茭白黑粉菌二型态转换的影响因素分析及乙醛酸循环关键基因功能初探

摘要

茭白黑粉菌(Ustilago esculenta)是茭白体内的一种内生真菌,其共生能引起茭白茎基部膨大,形成可食用的水生蔬菜—茭白。茭白田间有三种表型:正常茭白、灰茭及雄茭,三种表型与茭白黑粉菌在茭白体内的生长状态密切相关。研究发现,分离自正常茭白茎部的黑粉菌主要以菌丝状形态存在,呈M-T(mycelia-teliospore)型,而分离自灰茭的黑粉菌主要以孢子形态存在,呈 T(teliospore)型。目前两种茭白黑粉菌的研究主要集中在形态和蛋白组差异方面,本文系统分析了培养基成分、pH值、温度等对茭白黑粉菌体外培养时形态变化的影响;克隆获得了2个乙醛酸循环途径关键基因的全长序列,比较分析了其在茭白黑粉菌形态变化中的差异表达;构建了茭白黑粉菌遗传转化体系,并对克隆获得的基因进行了初步的功能鉴定。
　　(1)分别采用7种碳源、8种氮源、10种碳氮比组合、4种不同 pH值的培养基培养分离自龙茭2号的 M-T型和 T型茭白黑粉菌,同时使用PDA培养基在20℃、28℃、37℃培养两种茭白黑粉菌,观察其生长情况。结果表明:M-T型茭白黑粉菌只在半乳糖或蔗糖为唯一碳源的培养基和pH等于5时出现形态变化,由 M-T型向 T型转变;而 T型茭白黑粉菌在分别以蔗糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、果糖为唯一碳源,脲、酒石酸胺、蛋白胨、甘氨酸、硫酸胺、硝酸钾、硝酸胺、谷氨酸钠为唯一氮源,碳氮比分别为10:1、20:1、40:1、50:1的培养基及pH分别为3、5、6时出现形态变化,在体外培养的第8-10天时由 T型向M-T型转变。在不同温度培养下,20℃环境下茭白黑粉菌生长缓慢,28℃环境下茭白黑粉菌生长较快,形态均未发生变化,37℃时,两种菌均不生长。
　　(2)基于转录组及表达谱数据,选取了在M-T型茭白黑粉菌和T型茭白黑粉菌中差异表达显著的 UeICL基因(logFC=4.935)和UeMCP基因(logFC=1.986)进行克隆和荧光定量 PCR。结果表明,UeICL基因全长2059bp,UeMCP基因全长1317bp,UeICL基因和UeMCP基因在不同的碳源培养基中培养不同时间的茭白黑粉菌中差异表达明显,以 PD培养基中培养4天的 T型茭白黑粉菌中UeICL基因和UeMCP基因的表达量作为对照,UeICL基因在麦芽糖培养基、蔗糖培养基、葡萄糖培养基中培养4天的T型茭白黑粉菌中相对表达量分别为17.106,2.929,1.996;UeMCP基因在麦芽糖培养基、蔗糖培养基、葡萄糖培养基中培养4天的T型茭白黑粉菌中相对表达量分别为3.107,2.154,0.881,两个基因均在麦芽糖培养基中的表达量最高。
　　(3)利用原生质体转化方法构建了茭白黑粉菌的遗传转化体系。用PDA培养基培养T型茭白黑粉菌至OD600=0.8,使用7mg/mL的novozyme酶酶解40min制备原生质体,所得到的原生质体在含有0.6mol/L蔗糖的PDA再生培养基中进行再生实验,再生效果良好。在 STC-PEG的介导下,使用线性化的 pUMa207质粒转化原生质体,能获得稳定遗传的转化子。
　　(4)UeICL基因敲除菌株的构建。在 pUMa1467载体的基础上,利用golden gate cloning技术构建了 UeICL基因的敲除转化载体,经 PCR、测序和酶切验证载体构建正确;采用建立的转化体系转化 T型茭白黑粉菌原生质体后,通过连续4代继代筛选,获得了23个再生转化子,PCR鉴定结果发现其中3个转化菌株同时具有UeICL特征序列和敲除菌株的上下游边界序列,推测原始菌株存在多个拷贝的 UeICL。与野生型菌株相比,有1个阳性菌株体外培养时形态存在明显变化,菌液中有大量菌丝出现,由此可见,UeICL在灰茭茭白黑粉菌体外培养的形态变化中具有重要的作用。

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表清单

1 绪论

1.1 茭白及茭白黑粉菌的研究进展

1.2 真菌形态变化研究进展

1.3 碳代谢与乙醛酸循环

1.4 真菌遗传转化方法研究

1.5 基因敲除技术

1.6 研究内容及意义

2 茭白黑粉菌体外培养形态变化的影响因素分析

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

3 乙醛酸循环关键基因的克隆及差异表达分析

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

4 茭白黑粉菌遗传转化体系构建

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

5 茭白黑粉菌UeICL基因敲除载体构建及基因功能分析

5.1 材料

5.2 方法

5.3 结果与分析

5.4 讨论

6 总结与展望

6.1 全文总结

6.2 课题展望

参考文献

作者简历