三羟基丙酸途径在酿酒酵母线粒体中的表达

目录

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摘要

1绪论

1．1研究背景

1．2 3-HP的生物合成

1．3利用线粒体进行细胞工程代谢

1．4本课题的主要研究内容

1．5本课题的创新之处

2常规实验方法

2．1实验仪器

2．2实验试剂

2．3实验培养基

2．4实验方法

2．4．1常规PCR反应以及相关程序

2．4．2 PCR DNA产物纯化回收

2．4．3采用Golden-Gate构建质粒载体

2．4．4大肠杆菌感受态的制备及转化

2．4．5提取大肠杆菌质粒

2．4．6质粒酶切验证

2．4．7感受态酿酒酵母细胞的制备以及转化

2．4．8酿酒酵母全基因组DNA快速提取

2．4．9测定细胞浓度

2．4．10酵母发酵

2．4．11 3-HP含量的测定

2．4．12乙醇沉淀DNA的方法

3酿酒酵母中三羟基丙酸途径的线粒体定位

3．1实验流程

3．2实验所用的菌株、构建的载体以及合成引物

3．3 pCaMCR质粒的构建

3．4 3-HP生产菌的表征

3．4．2重组酿酒酵母CEN．PK 113-5D酵母菌株的补料发酵

3．4．3重组酿酒酵母CEN．PK 113-5D-M81菌株的发酵

4酿酒酵母线粒体中乙酰辅酶A前体供应的优化

4．1实验所用的菌株、构建的载体、donor以及合成引物

4．2 HFA1基因启动子的替换

4．2．1 pHfal-Cas9质粒的构建

4．2．2 Donor的合成

4．3 3-HP生产菌的表征

4．3．2重组酿酒酵母CEN．PK 113-5D-Hfal菌株的发酵

4．3．3酿酒酵母CEN．PK 113-5D-M81中Hfal启动子的替换

4．3．4重组酿酒酵母CEN．PK 113-5D-M81-Hfal菌株的发酵

5结论与展望

5．1结论

5．2展望

参考文献

致谢

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