CTX-M型ESBLs分子流行病学及CTX-M-3亚型克隆表达与纯化研究

摘要

目的： 了解温州地区流行性超广谱β内酰胺酶（ESBLs）细菌的检出率，构建ESBLs基因文库，对CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶的特性进行研究。 方法： 1．收集2005年10月至2006年9月温州医学院附属第一医院临床标本分离的产ESBLs肠杆菌科细菌63株。 2．PCR及DHPLC检测：63株产ESBLs菌株分别沸水浴10分钟做为模板，先多重PCR之后，再以各组通用引物检测，之后采用DHPLC进一步分析。 3．CIX-M-3、SHV-1重组质粒的构建：PCR扩增CTX-M-3、SHV-1的完整编码基因，和pET28a质粒重组。提取重组质粒进行内切酶双酶切和测序鉴定。 4．CTX-M-3重组蛋白的诱导表达、活性检测，以及重组蛋白纯化的初步探索：IPTG诱导CTX-M-3重组质粒感染菌BL21表达重组蛋白，收取表达上清进行重组蛋白的活性研究，计算出分解抗生素的米氏常数Km值。并且使用AKTA纯化系统，对CTX-M-3重组蛋白的纯化进行初步探索。 结果： 1．63株多重耐药菌株经PCR、DHPLC实验和测序：9株携带CTX-M-1组基因，除一株外，其余只检出blaCTX-M-3型基因；27株携带CTX-M-9组基因，检出主要为bla CTX-M-14型基因；2株同时携带携带blaCTX-M-3和blaCTX-M-14；检出一株携带SHV-1型基因。 2．克隆CTX-M-3、SHV-1编码基因，以及重组质粒测序并确定其基因型，构建ESBLs基因文库。 3．CIX-M-3重组酶分解所测的5种抗生素（头孢噻肟、青霉素钠、头孢呋新、头孢硫脒、头孢曲松钠），Km值分别为29．6、69．6、35．1、201．2、14．4mol/L。 结论： 产CTX-M型ESBL s的菌株流行广泛，占产ESBLs肠杆菌科细菌总数的54%，构建了ESBLs基因文库，表达的CTX-M-3重组酶能分解多种抗生素。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写词表、氨基酸缩写

声明

前言

第一部分 超广谱β-内酰胺酶的基因分型与分子流行病学初步调查

一、材料与方法

二、结果

三、分析与讨论

第二部分 CTX-M-3、SHV-1型超广谱β-内酰胺酶表达载体的构建

一、材料与方法

二、结果

三、分析与讨论

第三部分 CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶表达、动力学特性及纯化的初步探索

一、材料与方法

二、结果

三、分析与讨论

全文小结

参考文献

附录 实验设计技术路线图

致谢

综述 超广谱β-内酰胺酶分子生物学的研究