C57BL/6小鼠近视动物模型巩膜COL1α1启动子CpG岛甲基化的实验研究

摘要

目的：
　　 1.探讨C57BL/6小鼠形觉剥夺性近视动物模型的建立方法,揭示小鼠实验性近视形成的敏感期；
　　 2.明确C57BL/6小鼠实验性近视动物模型巩膜COL1α1基因mRNA水平的变化；
　　 3.研究C57BL/6小鼠实验性近视动物模型巩膜COL1α1启动子区域CpG岛甲基化水平的变化。
　　 方法：
　　 1.建立C57BL/6小鼠形觉剥夺性近视动物模型:23日龄C57BL/6小鼠74只,随机分为3组,单眼形觉剥夺组:分别剥夺2周(n=12)、3周(n=20)和4周(n=18),对侧眼作为自身对照；形觉剥夺恢复组(n=10):单眼形觉剥夺4周,分别恢复4天和7天；正常对照组(n=14)。实验前后分别用红外偏心摄影验光仪测量小鼠眼球的屈光状态,修正过的人眼角膜曲率计测量角膜曲率半径,步进电机式光学相干断层扫描仪测量眼球生物学参数,包括眼前节、玻璃体腔深度和眼轴长度等。
　　 2.C57BL/6小鼠实验性近视巩膜COL1α1mRNA水平的变化:取单眼形觉剥夺4周、单眼遮盖4周,恢复7天以及年龄相匹配的正常对照组C57BL/6小鼠各10只。分离巩膜组织,实验眼、对侧眼、对照眼按随机数字表,分别每两只巩膜合并提取总RNA,逆转录为cDNA,realtime PCR检测每组巩膜中COL1α1的表达。
　　 3.C57BL/6小鼠实验性近视巩膜COL1α1启动子区域CpG岛甲基化水平的变化:取单眼形觉剥夺4周、单眼遮盖4周,恢复7天以及年龄相匹配的正常对照组C57BL/6小鼠各10只。实验眼、对侧眼、对照眼按随机数字表,分别每两只巩膜合并提取基因组DNA,亚硫酸盐修饰后用克隆测序的方法检测不同处理眼巩膜组织COL1α1启动子区域CpG岛甲基化状况。统计学处理采用SPSS11.5统计学软件,组内实验眼对侧眼比较采用配对t检验,不同组间比较采用独立样本t检验。
　　 结果：
　　 1.形觉剥夺2周,实验眼相比对侧眼向近视方向漂移(-0.85±1.65)D(P>0.05),眼球各生物学参数未见明显改变；形觉剥夺3周,实验组相比对照组向近视方向漂移(-4.27±1.60)D(P>0.05),伴有玻璃体腔深度增加(10±7)μm(P>0.05)和眼轴延长(6±8)μm(P>0.05)；形觉剥夺4周组,实验眼相比对侧眼向近视方向漂移(-5.22±1.28)D(P<0.05)并伴玻璃体腔深度增加(27±13)μm(P<0.05)和眼轴延长(284-12)μm(P<0.05)；去除眼罩4天实验性近视迅速向远视方向漂移,直到去除眼罩7天,实验性近视完全恢复。
　　 2.经过4周形觉剥夺,实验眼巩膜COL1α1 mRNA水平下降了42％,实验眼和正常对照眼差异具有明显统计学意义(P〈0.05)；恢复7天后COL1α1表达上调,但仍较正常对照眼低。
　　 3.形觉剥夺4周,实验眼巩膜COL1α1启动子区域CpG岛存在普遍高甲基化,对侧眼呈现中度甲基化,对照眼存在普遍低甲基化,实验眼与对照眼甲基化水平存在明显统计学差异(P<0.05),但与对侧眼之间并没有明显的统计学差异(P>0.05)；去除眼罩7天,实验眼甲基化水平下降,存在普遍低甲基化,实验眼恢复期甲基化水平较形觉剥夺4周存在明显的统计学差异(P<0.05),对侧眼和对照眼甲基化水平较剥夺4周眼未见明显变化。
　　 结论：
　　 1.C57BL/6小鼠单眼形觉剥夺4周可诱导出相对轴性近视,但诱导时间较其他近视动物模型长；去除眼罩7天,实验性近视完全恢复；
　　 2.小鼠实验性近视形成期巩膜COL1α1 mRNA水平下调,恢复期上调；表明视觉信号能够调控控制巩膜重塑的COL1α1的表达；
　　 3.小鼠形觉剥夺性近视形成和恢复的过程中,巩膜COL1α1基因启动子区域CpG岛存在甲基化位点且其状态发生了变化；
　　 4.DNA甲基化可能参与了COL1α1的转录调控,但具体机制还不明确。DNA甲基化可能在实验性近视巩膜重塑中发挥重要作用,为近视研究提供了新的方向。