RNAi沉默多发性骨髓瘤DKK1基因对成骨细胞分化的影响

摘要

目的：
　　 通过实验证实多发性骨髓瘤细胞株U266表达DKK1,其上清液能够抑制鼠成骨祖细胞MC3T3E1的成骨分化过程,并通过RNAi致DKK1基因沉默,DKK1表达下降,从而减轻对小鼠成骨祖细胞MC3T3-E1成骨分化的抑制,初步探讨DKK1在骨髓瘤骨病(MBD)发病中的作用。
　　 方法：
　　 1.RT-PCR方法测定多发性骨髓瘤细胞株U266在mRNA水平上是否表达DKK1,采用Western blot方法检测多发性骨髓瘤细胞株U266上清液中是否存在可溶性的DKK1。
　　 2.将重组质粒pLenti6/V5-Gw/DKK-1-miR,与慢病毒包装质粒一起经脂质体2000转染293FT细胞,48h后收获细胞上清液获得慢病毒,高速离心浓缩后感染骨髓瘤细胞株U266,经Blasticidin筛选后得到DKK1基因长期沉默的U266细胞株,RT-PCR检测胞浆DKK1 mRNA表达和Western blot法检测浓缩50倍的细胞上清液中DKK1蛋白的表达来分析DKK1 RNAi的效率。
　　 3.将U266原细胞株、DKK1 RNAi U266细胞株和无关序列RNAi的U266细胞株等3种细胞培养上清液以30％浓度的量分别加入BMP-2诱导MC3T3-E1成骨祖细胞分化体系中,12天后观察3者对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响,观察指标为MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)和核心结合因子1(Cbfa-1)的mRNA水平,碱性磷酸酶(ALP)染色结节计数和钙结节计数。
　　 结果：
　　 1.慢病毒高速离心浓缩15倍后感染NIH3T3细胞,48h表达增强型绿色荧光蛋白(EmGFP),流式细胞术检测NIH3T3细胞EmGFP表达率计算出慢病毒浓缩液滴度为4.27×105TU/ml；
　　 2.采用半定量RT-PCR法可检测到骨髓瘤细胞株U266表达较高的DKK1 mRNA,并且在骨髓瘤细胞株U266上清液中以Western blot法可检测到可溶性DKK1蛋白。结果证实在U266细胞株中存在DKK-1的表达。
　　 3.我们观察加入30％U266上清至鼠成骨诱导体系中12天后,观察到成骨分化明显抑制,ALP、Cbfa-1、OCmRNA表达,钙结节计数,ALP结节计数明显降低。(ALP结节及钙结节计数及P<0.001,mRNA均P<0.05)。
　　 4.与普通U266细胞比较,DKK1 RNAi U266细胞的DKK1表达量有明显减少(P<0.001),抑制率达50％以上。且经过多次冻存、传代后,再次检测相关指标发现DKK1仍被稳定抑制。
　　 5.我们看到30％DKK1 RNAi U266上清干预组与30％U266上清干预组比较,ALP、Cbfa-1、OC表达,钙结节计数,ALP结节计数明显升高(ALP结节和mRNA P<0.05,钙结节计数P<0.01),而与诱导组比较,ALP、Cbfa-1、OC表达,钙结节计数,ALP结节计数变化不明显(P>0.05)。30％无关序列shRNA U266上清干预组与30％U266上清干预组比较,ALP、Cbfa-1、OC表达,钙结节计数,ALP结节计数无明显差别(P>0.05),30％无关序列shRNA U266上清干预组与30％DKK1 shRNA U266上清干预组比较,ALP、Cbfa-1、OC表达,钙结节计数,ALP结节计数有所降低(ALP、OC,P<0.01；Cbfa-1,P<0.05,ALP结节计数P<0.001,钙结节计数P<0.001)。
　　 结论：
　　 1.多发性骨髓瘤细胞株U266在mRNA和蛋白水平上均表达DKK1。
　　 2.30％多发性骨髓瘤细胞U266培养上清液能够抑制BMP2诱导的成骨祖细胞MC3T3E-1成骨分化过程。
　　 3.慢病毒介导的RNAi能有效抑制骨髓瘤细胞U266中DKK1的表达,具有高效性,稳定性。
　　 4.U266细胞经DKK1 RNAi后,其抑制鼠成骨祖细胞MC3T3E-1分化能力减弱。