吲哚美辛对脉络膜黑色素瘤细胞增生活性的影响及作用机制研究

摘要

目的：观察环氧化酶抑制剂吲哚美辛(indomethacin，IN)对脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1增生活性及侵袭力的影响，并检测IN作用前后OCM-1细胞内血管内皮生长因子(VEGF)及凋亡抑制因子(Survivin)的表达变化情况，以探讨IN对脉络膜黑色素瘤细胞增生活性的影响及其作用机制。
　　 方法：体外培养OCM-1细胞，应用不同浓度IN对OCM-1细胞进行干预，应用四氮唑化合物(MTT)法检测不同浓度IN对OCM-1细胞增生活性的影响；并通过MTT法筛选药物作用浓度范围，确定出IN对OCM-1细胞增生活性产生抑制作用的有效浓度范围，以指导后期的实验。通过侵袭实验法检测不同浓度IN对OCM-1细胞侵袭力的影响；逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同浓度IN对OCM-1细胞内血管内皮生长因子(VEGF)及凋亡抑制因子(Survivin)mRNA表达的调节作用；免疫荧光化学法检测OCM-1细胞内VEGF、Survivin2种蛋白的定位及表达情况，酶联免疫吸附测定(ELISA)检测不同浓度IN对OCM-1细胞内VEGF、Survivin2种蛋白表达的影响，并通过蛋白免疫印迹法(Westernblot)验证上述的实验结果。
　　 结果：1、MTT法：不同浓度IN对OCM-1细胞的增生活性有明显的抑制作用，其抑制率呈浓度-时间依赖性(MTT:24h:F=19.642，P＜0.01;48h:F=136.597,P＜0.01;72h:F=582.543,P＜0.01);IN作用24、48h时，对OCM-1细胞增殖抑制的起始浓度为25.0μmol/L，作用72h时，对OCM-1细胞增殖抑制的起始浓度为12.50μmol/L。
　　 2、侵袭实验：不同浓度IN对OCM-1细胞的侵袭力有明显的抑制作用，其抑制率呈浓度-时间依赖性（F=54.225，P＜0.01）；
　　 3、免疫荧光化学结果表明VEGF、Survivin2种因子在OCM-1细胞内均呈阳性表达，且多数表达于细胞胞浆内；
　　 4、RT-PCR法：结果显示100、200、400μmol/LIN可抑制OCM-1细胞内SurvivinmRNA的表达（F=16.679，P＜0.01），此三组试验中，SurvivinmRNA的相对表达量分别为(0.49±0.10)、（0.39±0.08）、（0.28±0.03）；而IN作用后，OCM-1细胞内VEGFmRNA的表达并未受抑制。
　　 5、ELISA法测出阴性对照组、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0μmol/LIN组OCM-1细胞内Survivin浓度分别为(787.33±47.37)、(524.33±24.44)、(369.67±16.26)、(257.00±26.21)、(195.33±24.70)、(123.33±8.02)pg/ml，这表明IN可呈浓度依赖性的抑制OCM-1细胞内Survivin蛋白的表达(F=243.252，P＜0.01)，而IN作用后，细胞内VEGF的表达量及细胞培养上清液中VEGF的分泌量并无降低.甚至有升高的趋势。
　　 6、Westernblot进一步验证了IN可抑制OCM-1细胞内Survivin蛋白的表达，但对细胞内VEGF的表达并无抑制作用。
　　 结论：Survivin蛋白在OCM-1细胞内呈阳性表达，不同浓度IN作用后，OCM-1细胞内Survivin蛋白的表达显著下降，IN能够抑制OCM-1细胞的增生及侵袭，其机制可能与其下调OCM-1细胞内Survivin因子的表达有关。