W-7对惊厥持续状态幼年大鼠海马CaM、GRP78和Caspase-12表达的影响

摘要

目的：1．研究惊厥持续状态(SC)幼年大鼠海马CaM、GRP78和Caspase-12表达的变化，并探讨GRP78/Caspase-12通路介导的内质网应激反应性凋亡途径在惊厥性脑损伤中的作用。
　　 2．探讨钙调蛋白抑制剂(W-7)对CaM、GRP78和Caspase-12表达的影响，及其对惊厥性脑损伤的意义。
　　 方法：19～21日龄清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠117只，体重60～70g，用随机数字表法将大鼠随机均分入生理盐水对照(NS)组、惊厥持续状态(StatusConvulsion，SC)组、W-7预处理(W-7)组，每组再随机分为4h、24h、48h组3个亚组，每亚组13只。采用氯化锂-匹罗卡品法制作大鼠惊厥持续状态(SC)模型：氯化锂按3mEq/kg（127mg/kg）剂量腹腔注射，18h后腹腔注射溴化甲基东莨菪碱1mg/kg，30min后腹腔注射匹罗卡品100mg/kg。观察大鼠行为学变化，记录大鼠的惊厥率、惊厥潜伏期、惊厥程度分级及死亡情况；选择惊厥发作达到Ⅳ及Ⅳ以上，持续时间达30min，惊厥缓解后状态良好的大鼠为合格SC大鼠模型。NS组以生理盐水代替氯化锂及匹罗卡品，其他处理同SC组；SC组按照SC模型制作；W-7组大鼠在注射PILO前15分钟，予尾静脉注射W-750μM/Kg，其他处理同SC组。三组分别于相应的时间点处死。采用光镜观察大鼠海马组织病理学改变情况；采用电镜观察大鼠海马神经细胞及亚细胞超微结构凋亡情况；采用TUNEL法检测各时间点海马神经元凋亡细胞数的变化情况；采用免疫组织化学法检测CaM、GRP78和Caspase-12蛋白的表达变化情况；采用RT-PCR法检测CaM、GRP78和Caspase-12mRNA的表达变化情况。
　　 结果：1．惊厥持续状态模型的建立：注射匹罗卡品后，有3只(3/78)大鼠未成功诱发惊厥，16只(16/78)出现Ⅳ发作，其余大鼠58只(58/78)均诱导出Ⅴ级惊厥发作。总死亡大鼠9只(9/78，11.54％)，造模过程中死亡大鼠1只(1/78)，3只(3/78)于惊厥后4h内死亡；3只(3/78)于惊厥后24h死亡；2只(2/78)于48h死亡；其死亡高峰位于惊厥后4h～24h。
　　 2．HE染色：NS组各时间点大鼠海马CA1区神经元排列整齐，细胞轮廓清晰；SC组SC后4h仅见极少神经元肿胀，24h出现胞核固缩，胞浆空泡化，部分神经元核仁消失，48h后病理改变较24h明显加重，受累及神经元迅速增多，可见红色神经元；W-7组大鼠各时间点也可见到不同程度的神经元变性、丢失，程度重于NS组，但较SC组明显减轻。
　　 3．电镜：NS组各时间点大鼠海马CA1区神经元结构清晰完整，细胞器丰富；SC组SC后4h海马CA1区出现血管周围间隙水肿，24h少量神经元出现核固缩，部分细胞器轻度扩张，突触间隙肿胀，48h可见较多神经元核固缩，胞质染色变深，细胞器空泡样变性明显；W-7组各时间点海马CA1区神经元超微结构改变重于NS组，轻于SC组。
　　 4．TUNEL法检测神经元凋亡结果：NS组各时间点大鼠海马CA1区均可见极少量TUNEL阳性细胞表达；SC组SC后4hTUNEL阳性细胞开始表达，24h已经明显升高，48h达高峰，与NS组、W-7组比较均有统计学意义(P＜0.01);W-7组TUNEL阳性细胞变化趋势与SC组相似，且各相应时间点显著降低，但仍高于NS组(P＜0.01)。
　　 5．免疫组化检测结果：
　　 (1)CaM蛋白表达情况：NS组各时间点大鼠海马CA1区CaM蛋白少量表达，组间无显著性差异(P＞0.05)；SC后4h表达即明显增加，24h达峰，48h下降，各时间点表达量高于NS组(P＜0.01);W-7组变化趋势与SC组相似，各时间点表达量较SC组降低，较NS组升高（P＜0.05或P＜0.01）。
　　 (2)GRP78蛋白表达情况：NS组各时间点大鼠海马CA1区GRP78蛋白少量表达，组间无显著性差异(P＞0.05):SC组SC后4h开始增加，24h达峰，48h下降，24h、48h表达量高于NS组(P＜0.01):W-7组变化趋势与SC组相似，24h、48h表达量较SC组、NS组明显升高(P＜0.05或0.01)。
　　 (3)Caspase-12蛋白表达情况：NS组各时间点大鼠海马CA1区Caspase-12蛋白少量表达，组间无显著性差异(P＞0.05):SC组SC后4h开始增加，24h达峰，48h下降，24h、48h表达量高于NS组(P＜0.01):W-7组变化趋势与SC组相似，24h、48h表达量较SC组降低，较NS组升高（P＜0.01）。
　　 6．RT-PCR检测结果：
　　 (1)CaMmRNA表达情况：NS组各时间点之间CaMmRNA表达无显著性差异(P＞0.05);SC组SC后4h开始增加，24h达峰，48h下降，各时间点表达量高于NS组(P＜0.01);W-7组变化趋势与SC组相似，各时间点表达量较SC组降低，与NS组相比其表达量在4h、24h时间点显著升高(P＜0.01)。
　　 (2)GRP78mRNA表达情况：NS组各时间点之间GRP78mRNA表达无显著性差异(P＞0.05);SC组SC后4h开始增加，24h达峰，48h下降，24h表达量高于NS组(P＜0.01):W-7组变化趋势与SC组相似，各时间点表达量较SC组、NS组显著升高(P＜0.05或0.01)。
　　 (3)Caspase-12mRNA表达情况：NS组各时间点之间Caspase-12mRNA表达无显著性差异(P＞0.05);SC组SC后4h开始增加，24h达峰，48h下降，各时间点表达量高于NS组(P＜0.01);W-7组变化趋势与SC组相似，各时间点表达量较SC组降低，与NS组相比其表达量在24h时间点显著升高（P＜0.01）。
　　 7．相关性分析：大鼠海马GRP78mRNA与CaMmRNA呈正相关，GRP78mRNA与Caspase-12mRNA呈正相关，Caspase-12mRNA与CaMmRNA呈正相关（γ=0.680，0.781，0.939，P＜0.01）。海马CA1区GRP78蛋白与CA1区Caspase-12蛋白，Caspase-12蛋白与CaM蛋白呈正相关(γ=0.781，0.590，P＜0.01)。海马CA1区TUNEL阳性细胞与CA1区GRP78蛋白、CaM蛋白、Caspase-12蛋白均呈正相关(γ=0.685，0.485，0.710，P＜0.01)。
　　 结论：1．幼年大鼠SC后海马存在不同程度的神经元凋亡，提示SC可致海马神经元损伤。
　　 2．GRP78、Caspase-12mRNA和蛋白表达在SC后的幼年大鼠海马中均增高，表明内质网应激可能参与了SC后幼年大鼠的惊厥性脑损伤过程。
　　 3．SC后早期CaM即表达增高，同时GRP78与Caspase-12的表达也相应增高，故我们推测SC可能通过激活CaM而促发ERS，表明CaM在SC后幼年大鼠海马损伤早期的发生发展中起重要作用。
　　 4．钙调蛋白抑制剂W-7可通过抑制CaM的表达，上调GRP78和下调Caspase-12的表达，进而减轻神经元凋亡，降低SC后海马损伤程度。