以HPV16L2为载体携带CtMOMP多表位的免疫效应研究

摘要

目的：
　　 1构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)/HPV16L2，以研究HPV16型L2全长基因的在真核细胞中的表达情况。
　　 2构建pcDNA3.1(+)/CtMOMP多表位/HPV16L2嵌合重组质粒，验证嵌合重组质粒在真核中的表达及嵌合病毒样颗粒形成的情况。
　　 3通过免疫BALB/c小鼠，研究重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV16L2和pcDNA3.1(+)/CtMOMP多表位/HPV16L2嵌合重组质粒的免疫原性。
　　 4研究pcDNA3.1(+)/CtMOMP多表位/HPV16L2嵌合重组质粒对小鼠生殖道E血清Ct感染的免疫保护作用。
　　 方法：
　　 1．利用实验室已有的质粒PGEX-4T-1-HPV16L2通过PCR的方式扩增出HPV16L2全长，将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)上，构建pcDNA3.1(+)/HPV16L2真核重组质粒。利用转染试剂lipofectamineTM2000转染COS-7细胞，通过间接免疫荧光和透射电镜观察鉴定L2基因的表达及形成病毒样颗粒的情况。
　　 2．利用实验室已有的质粒pcDNA3.1(+)/CtMOMP多表位，设计引物扩增出CtMOMP多表位基因，将其亚克隆至质粒pcDNA3.1(+)/HPV16L2上，构建出pcDNA3.1(+)/CtMOMP多表位/HPV16L2嵌合重组质粒。经PCR、酶切和测序分析进行鉴定。用转染试剂lipofectamineTM2000转染COS-7细胞，通过间接免疫荧光和Westernblot分析鉴定pcDNA3.1(+)/CtMOMP多表位/HPV16L2的真核表达，并通过透射电镜观察插入的CtMOMP多表位序列是否影响HPV16L2病毒样颗粒(VLP)的组装。
　　 3．采用1、3、5周免疫程序，肌肉注射方式，重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV16L2，pcDNA3.1(+)/CtMOMP多表位重组质粒和嵌合重组质粒pcDNA3.1(+)/CtMOMP多表位/HPV16L2，分别免疫BALB/c小鼠，每次100μg/100μlPBS/只，同时设置对照组PBS组、pcDNA3.1(+)组，通过间接ELISA法检测免疫后小鼠血清中特异性抗体IgG及IgA，同时采用LDH释放法检测小鼠脾脏淋巴细胞CTL细胞杀伤活性以验证嵌合重组质粒pcDNA3.1(+)/CtMOMP多表位/HPV16L2诱导机体产生的体液免疫和细胞免疫效应。
　　 4．末次免疫后1周，以106包涵体形成剂量的Ct攻击BALB/c小鼠生殖道，通过外生殖道炎症观察、阴道分泌物PCR鉴定、阴道病理标本观察等分析pcDNA3.1(+)/CtMOMP多表位/HPV16L2嵌合重组质粒的免疫保护效应。
　　 结果：
　　 1．经酶切分析和测序证实重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV16L2构建成功；转染COS-7细胞后，经间接免疫荧光证及透射电镜观察发现该质粒在COS-7细胞的蛋白表达，且定位于胞浆。
　　 2．经PCR，酶切及测序鉴定嵌合重组质粒pcDNA3.1(+)/CtMOMP多表位/HPV16L2构建成功；转染COS-7细胞后，经间接免疫荧光和WesternBlot分析，均证实了其可以在真核细胞中表达，且主要定位于胞浆，呈不均匀颗粒状。电镜观察显示细胞胞浆中有50-60nm的病毒样颗粒形成，提示嵌合重组质粒pcDNA3.1(+)/CtMOMP多表位/HPV16L2可在真核细胞胞浆表达，且不影响HPV16L2病毒样颗粒的组装。
　　 3．BALB/c小鼠经pcDNA3.1(+)/CtMOMP多表位/HPV16L2质粒免疫后，诱导其产生的血清，ELISA分析结果显示，能产生对沙眼衣原体全菌体的血清特异性IgG和IgA，于末次免疫后一周达峰值，与对照PBS组及载体组相比，统计分析发现均有显著性差异（P＜0.05）。LDH检测小鼠脾细胞的CTL细胞活性，结果显示免疫后产生对靶细胞的特异性杀伤作用，并随效靶比(E/T)的增高杀伤率也增高
　　 4．末次免疫后第7周，各实验组经Ct生殖道攻击后，通过观察小鼠生殖道炎症：感染后5天，各组小鼠出现不同程度的炎症表现，采集阴道分泌物进行PCR鉴定可扩增出CtMOMP全长DNA，生殖器病理切片观察PBS组和载体组输卵管感染Ct后输卵管积水、充血，管腔变薄，上皮细胞肿胀，绒毛消失。嵌合重组质粒组可达25天左右，而PBS组和载体组炎症持续时间可达30天。
　　 结论：
　　 1．成功构建了重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV16L2，并在真核细胞中得以有效地表达。
　　 2．成功构建了嵌合重组质粒pcDNA3.1(+)/CtMOMP多表位/HPV16L2，在真核细胞中表达了嵌合蛋白，并可自组装形成病毒样颗粒。
　　 3．pcDNA3.1(+)/HPV16L2重组质粒能在小鼠体内产生良好的免疫效应，pcDNA3.1(+)/CtMOMP多表位/HPV16L2嵌合重组质粒免疫小鼠后，能刺激其产生细胞免疫和全身的HPV16L2和CtMOMP多表位特异性的体液免疫及粘膜局部的体液免疫反应。为研究HPV多表位核酸疫苗及HPV-CT嵌合疫苗的免疫保护效应提供实验基础。
　　 4．pcDNA3.1(+)/CtMOMP多表位/HPV16L2嵌合重组质粒对小鼠生殖道Ct感染具有较强的免疫保护作用。