移植了肿瘤细胞的卵用于不存在除移植卵中的免疫效应细胞以外的免疫效应细胞时研究免疫疗法的抗癌有效性的用途

摘要

本发明涉及一种移植了肿瘤细胞的含胚卵模型用于研究免疫治疗分子的抗癌有效性或筛选免疫治疗分子的用途，其中不存在除移植卵中的免疫效应细胞以外的免疫效应细胞。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫肿瘤学领域，特别涉及个性化医疗，以向癌症患者开出在有效性方面最有前景的免疫疗法处方。

背景技术

尽管在癌症治疗中已经存在治疗方案(外科手术、辐照、化学疗法和靶向疗法)，但一些恶性肿瘤仍然无法治愈，直到发现免疫系统可以作用于肿瘤的机制。

本领域的这些进展导致了一种称为免疫疗法的新治疗方法的开发，其力求重新激活或刺激免疫系统以特异性攻击肿瘤细胞。

免疫疗法的兴趣之一是开发治疗方法，其不依赖于给定的癌症类型、而是依赖于肿瘤中的遗传特征和特定生物标志物(PDL-1型)的存在。因此，这些治疗考虑了患者及其肿瘤的特征，是朝着个性化医疗迈出的第一步。

自2010年以来，考虑采取各种行动，并取得了有前景的结果：

-使用结合或不结合细胞毒性分子的单克隆抗体，

-使用免疫检查点抑制剂(在癌症机制中被特异性激活或抑制的通路的检查点)激活或抑制某些在发展中涉及免疫系统的机制，例如使用CTLA-4抑制剂(伊匹单抗)，

-刺激免疫系统以更有效地对抗肿瘤细胞，尤其是采用非靶向免疫疗法、预防性或治疗性癌症疫苗，

-使用过继细胞疗法，例如CAR-T细胞(嵌合抗原受体T淋巴细胞)，其目的是在体外修饰患者的细胞、然后将其重新注入患者以对抗肿瘤，并取得了有前景的结果。

大多数免疫疗法的有效性需要免疫细胞的存在，这限制了体外测试此类分子的可能性。因此，研发阶段迅速转移到动物模型中，主要是在小鼠中。

自发发展出肿瘤的小鼠模型不具有患者肿瘤中存在的遗传复杂性，所述遗传复杂性可以抑制或相反地放大任何治疗效果。因此，这使得难以将结果外推到人。

用于异种移植的第一个体内模型是免疫缺陷小鼠，其促进不受宿主免疫系统攻击的肿瘤的发展。然后通过表达人基因(敲入)来建立转基因模型、或通过将人造血细胞移植至免疫缺陷小鼠中，从而对这些小鼠模型进行“人源化”。然而，这些模型有多项缺点，例如开发模型所需的时间(可能需要花费数月才能获得任何结果)，或者肿瘤发展速度比在人中更快，肿瘤发展不会像在人肿瘤环境中那样伴随着慢性炎症。

鉴于这些在人源化小鼠模型中进行研究的困难、相关成本以及所需时间，需要开发其他更简单、更快和更可靠的模型，以开发和验证新免疫疗法的有效性。

发明内容

本发明涉及移植了肿瘤细胞，特别是在绒毛尿囊膜(CAM)水平上移植了肿瘤细胞的含胚鸟卵模型用于评估一种或多种免疫治疗分子的抗癌活性的用途，其中所述模型排除了移植卵的免疫效应细胞以外的免疫效应细胞的存在。

优选地，所述免疫治疗分子选自过继细胞疗法(例如CAR-T)、疫苗、双特异性抗体、免疫检查点抑制剂(例如抗PD1、或抗PDL1、或抗CTLA-4抗体)。

特别地，当肿瘤细胞是从癌症患者样品中分离出时，测试多种免疫治疗分子使得可以确定哪一种分子在该患者的癌症治疗效果方面是最有前景的。

在所述含胚卵的用途的范围内，还可能测定或甚至定量所测试的免疫治疗分子的毒性，所述毒性是对从移植的肿瘤细胞发展而来的肿瘤的毒性以及对胚胎整体的毒性。

本发明还涉及评估一种或多种免疫治疗分子的抗癌活性的方法，其特征在于其包括：

-在含胚鸟卵的绒毛尿囊膜(CAM)水平上移植肿瘤细胞，所述含胚鸟卵预先孵育到与CAM形成相对应且相当于在鸡胚中至少发育8天的发育阶段，

-移植至少12小时后，将免疫治疗分子施用至所述含胚卵中，

-研究施用的所述免疫治疗分子对移植胚胎中发展的肿瘤的肿瘤发生的作用，

并且其是在不存在且没有添加除移植卵的免疫效应细胞以外的免疫效应细胞的情况下实施的。

本发明还涉及一种筛选具有抗癌活性的免疫治疗分子的方法，其包括以下步骤：

-在含胚鸟卵的绒毛尿囊膜(CAM)水平上移植肿瘤细胞，所述含胚鸟卵预先孵育到与CAM形成相对应且相当于在鸡中至少发育8天的发育阶段，

-移植至少12小时后，将候选免疫治疗分子施用至所述含胚卵中，

-研究施用的所述免疫治疗分子对移植的含胚卵中发展的肿瘤的肿瘤发生的作用，

所述方法是在不存在且没有添加除移植卵的免疫效应细胞以外的免疫效应细胞的情况下实施的。

最后，本发明涉及一种监测患有癌症的患者或动物的方法，其包括：

-用来自所述患者或动物的在时间T1的肿瘤细胞制备如上所述的第一含胚鸟卵，并研究在所述第一含胚卵中发展的肿瘤的肿瘤发生，

-用来自同一个所述患者或动物的在时间T2的肿瘤细胞制备如上所述的第二含胚鸟卵，并研究在所述第二含胚卵中发展的肿瘤的肿瘤发生，

-比较在所述第一和第二含胚卵中发展的肿瘤的肿瘤发生，

所述方法是在不存在且没有添加除移植卵的免疫效应细胞以外的免疫效应细胞的情况下实施的。

本发明排除了所述含胚鸟卵的免疫效应细胞以外的免疫效应细胞的存在，所述含胚鸟卵中移植了肿瘤细胞。

在任何时候，根据本发明的用途和方法都不包括含胚卵的免疫效应细胞以外的免疫效应细胞的存在或添加，所述含胚卵中移植了肿瘤细胞。

附图说明

图1表示含胚卵模型，其中呈现了肿瘤细胞沉积区和主要组织。

图2表示从细胞移植至样品收集的研究时间表的一个示例。

图3表示阿特朱单抗(抗PD-L1，特善奇(Tecentriq))处理对起源于MDA-MB-231细胞的肿瘤的作用。

图4表示派姆单抗(抗PD1，可瑞达(Keytruda))处理对起源于(A)MDA-MB-231细胞或(B)SU-DHL-4细胞的肿瘤的作用。

图5表示RMP1-14(抗PD1)处理对起源于SU-DHL-4细胞的肿瘤的作用。

图6表示纳武单抗(抗PD1，欧狄沃(Opdivo))处理对起源于MDA-MB-231细胞的肿瘤的作用。

图7表示移植MDA-MB-231细胞后，派姆单抗(抗PD1，可瑞达)处理对下部CAM中转移的作用。

图8表示经过或未经过阿特朱单抗(抗PD-L1，特善奇)处理的从SU-DHL-4细胞获得的肿瘤中CD3(A)和CD4(B)表达的相对量(与阴性对照组相比)。

图9表示经过或未经过派姆单抗(抗PD-1，可瑞达)处理的从SU-DHL-4细胞获得的肿瘤中CD3(A)、CD45(B)、CD56(C)和CD8(D)表达的相对量(与阴性对照组相比)。

图10表示经过或未经过纳武单抗(抗PD1，欧狄沃)处理的由MDA-MB-231细胞获得的肿瘤中CD3表达的相对量(与阴性对照组相比)。

图11表示通过流式细胞术检测E16时鸡胚的外周血单个核细胞中的不同免疫细胞群(CD4+ T淋巴细胞、CD8+ T淋巴细胞和单核细胞)。

图12表示在用派姆单抗(抗PD-1，可瑞达

具体实施方式

本发明涉及移植了肿瘤细胞，特别是在CAM水平上移植了肿瘤细胞的含胚鸟卵用于评估一种或多种免疫治疗分子的抗癌活性的用途，其中所述模型排除了移植卵的免疫效应细胞以外的免疫效应细胞的存在。优选地，所述免疫治疗分子选自过继细胞疗法(例如CAR-T)、疫苗、双特异性抗体、免疫检查点抑制剂(例如抗PD1、或抗PDL1、或抗CTLA-4抗体)，或甚至更优选地选自过继细胞疗法(例如CAR-T)、双特异性抗体、免疫检查点抑制剂(例如抗PD1、或抗PDL1、或抗CTLA-4抗体)。有利地，所述免疫治疗分子选自免疫检查点抑制剂(例如抗PD1、或抗PDL1、或抗CTLA-4抗体)。

在绒毛尿囊膜(CAM)水平上移植了肿瘤的含胚卵，特别是鸡模型，已被广泛用于许多类型的抗癌治疗(例如化学疗法、多肽或纳米颗粒)的有效性和毒性测试。然而，其从未被用于测试免疫治疗抗癌分子的有效性，即，那些抗癌分子凭借癌症患者自身免疫系统的激活、或更精确地说是重新激活的有效性。

发明人证明了，出人意料地，所述模型可以以相同的方式用于测试免疫治疗分子的有效性，但仅使用移植卵的免疫系统，尽管其与人的免疫系统有很大不同，且许多作者可能已经考虑到鸡的免疫系统不成熟、因而不能导致任何免疫反应。因此，根据本发明的模型的用途是在不存在和不添加移植胚胎的免疫效应细胞以外的免疫效应细胞的情况下实施的。因此，所述实施仅凭借移植卵的免疫系统。

所述模型的实施与现有模型相比具有多个优点，例如：

-成本(所述卵与老鼠及其在动物房中维持数周或数月的费用相比)；

-完整的免疫系统的存在，其不需要移植的含胚卵的免疫效应细胞以外的免疫效应细胞的存在或添加。

此外，由于其为胚胎模型，其免疫系统仍在发育中。然而，移植后几个小时，所述免疫系统的成熟程度就足以使其被治疗性免疫化合物激活、从而验证化合物的有效性。

优选地，根据本发明的含胚卵是鸡形目或鸵形目的鸟的卵。特别地，所述卵特别优选地是鹑鸡类的卵，特别是鸡、鹌鹑、火鸡、野鸡、孔雀、珍珠鸡或其他农家鸟的卵。其也可以是鸵鸟卵。有利地，根据本发明的含胚卵是原鸡(Gallus gallus)卵。

在本发明的范围内，术语“含胚卵”是指受精的鸟卵，其中胚胎可以在适当的条件下，特别是37℃至38℃的温度下的孵育器中发育。在这些条件下，对于鸡，孵化卵所需的孵育时间为21天。

此处报道的发育阶段定义为卵受精后孵育时间的函数，特别是在如上定义的适当条件下的孵育时间。

“在CAM水平上移植”是指指定通过附着或注射施用在CAM上，无论是上部CAM或下部CAM。

根据本发明所用的含胚卵模型具有来自两种不同生物体或异种移植物的细胞：来自“宿主”或“受体”鸟的细胞，和来自人或与“受体”鸟不同物种的动物体的移植至卵中的肿瘤细胞。特别优选地，所述移植至含胚鸟卵中的肿瘤细胞是人细胞。然后，这些移植细胞将通过形成一个或多个实体瘤和/或在卵中移动而在胚胎中发展。

根据本发明，肿瘤细胞的移植在不存在含胚卵的免疫效应细胞以外的免疫效应细胞的情况下进行，并且所述卵的使用排除了移植卵的免疫效应细胞以外的免疫效应细胞的存在和添加。

根据定义，“在CAM水平上移植”发生于形成CAM后、且相当于在正常和标准生长条件下在鸡中发育至少8天的阶段。如果所用的鸟是鸡，则所述阶段对应于发育至少8天。由于发育天数可能在物种之间存在差异，移植可能发生于不同的发育天数。例如，在鸡中至少8天的发育阶段对应于在鹌鹑中至少6.5天的发育阶段。

应当理解，根据本发明所用的移植胚胎并非旨在孵化，因此并非旨在产生成年生物体。其在研究免疫治疗分子作用的期间仅被用作动物模型，而不会使用至孵化时(对应于在鸡中发育21天)。在任何情况下，在移植的肿瘤细胞导致卵中一个或多个肿瘤的发展之后以及在孵化之前，根据现行的道德准则，将处死根据本发明所用的鸟胚胎。

移植的肿瘤细胞可以是不同类型癌症的肿瘤细胞系，但也可以源自癌症患者的肿瘤样品，例如源自患者肿瘤的活检样品或任何其他包含源自患者的肿瘤细胞的生物学样品，条件是已去除免疫效应细胞，即仅肿瘤细胞从生物学样品中分离出来。

在本发明的范围内，无论是移植肿瘤细胞系还是移植去除了免疫效应细胞的癌症患者的生物学样品，使用含胚卵模型或实施根据本发明的方法时，都不会添加免疫效应细胞。

根据本发明的一个实施方案，获自患有癌症的患者或动物的样品的肿瘤细胞是循环肿瘤细胞(CTC)，其在移植至含胚卵中之前已纯化。所述纯化可以通过技术人员已知的任何方法来实现。Zheyu Shen等人(2017)特别描述了许多不同的方法。当目的是捕获非靶标淋巴细胞和洗脱CTC时，这些方法可以实现所谓的“阴性”富集，而当目的是从样品中捕获CTC和洗脱非靶标淋巴细胞时，其可以实现所谓的“阳性”富集。其中，尤其可以提到当所述肿瘤细胞是循环肿瘤细胞(CTC)时，Han Wei Hou等人(2013)描述的和Laget S等人(2017)再次描述的内容；当所述肿瘤细胞是从患者细胞来源的异种移植物中分离的肿瘤细胞时(患者来源的异种移植物或PDX)，Petit Vincent等人(2013)描述的内容，最后是DeBordLogan C等人(2018)描述的内容。

优选地，所述患者是人个体。在这种情况下，所述样品是源自所述患者的肿瘤的异种移植物，或称为PDX(患者来源的异种移植物)。

移植至所述含胚卵中的所述肿瘤细胞尤其可以源自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肾癌和任何其他可以受益于免疫疗法的癌症。

有利地，根据本发明所用的含胚卵模型是鸡卵，其已在CAM水平上移植了肿瘤，所述肿瘤优选人细胞。优选地，移植的鸡卵模型的使用排除了人免疫效应细胞的存在。

“免疫效应细胞”是指淋巴细胞，特别是T、B和NK淋巴细胞、巨噬细胞和树突细胞。

在本发明的范围内，术语肿瘤和癌症可互换使用并且具有相同的含义，以定义恶性细胞的增殖。术语抗肿瘤和抗癌的使用也相同。

“免疫治疗分子”旨在指能够激活免疫反应、或恢复患者的免疫系统针对他或她的肿瘤产生的作用的任何化合物或产品。所述免疫治疗分子靶向控制已被肿瘤阻断的免疫系统的功能。所述化合物可以是抗体，尤其是单克隆抗体、佐剂、化学分子等。在根据本发明所用的含胚卵中，在这种情况下，所述免疫治疗分子能够刺激“宿主”或“受体”鸟针对从移植的肿瘤细胞发展而来的癌症的免疫反应。在所述免疫治疗分子中，尤其可以提到过继细胞疗法(例如CAR-T)、疫苗、双特异性抗体、免疫检查点抑制剂(例如抗PD1、或抗PDL1、或抗CTLA-4抗体)。

特别地，当所述肿瘤细胞是源自癌症患者样品时，测试多种免疫治疗分子使得可以选择对该患者的肿瘤治疗最有前景的免疫治疗分子。因此，根据本发明的一个优选的实施方案，所述移植了肿瘤细胞的含胚鸟卵被用于确定所测试的不同免疫治疗分子中哪一个具有最佳的抗癌活性。

所述移植了肿瘤细胞的含胚鸟卵还可以根据本发明用于测试免疫治疗分子的组合的抗癌有效性，与分别测试的每个分子所获得的效果相比。

在所述含胚卵的用途范围内，还可能测定或甚至定量所测试的免疫治疗分子的毒性，所述毒性是对从移植的肿瘤细胞发展而来的肿瘤的毒性以及对胚胎整体的毒性。因此，本发明的另一个目的涉及移植了肿瘤细胞的含胚鸟卵在定量一种或多种免疫治疗分子对肿瘤和/或对胚胎整体的毒性中的用途。

根据一个优选的实施方案，上述本发明的用途是用移植的含胚鸟卵进行的，所述鸟卵已被预先孵育到对应于CAM形成的发育阶段，并且相当于在鸡中至少发育9天或甚至更优选9.5天。

本发明还涉及评估一种或多种免疫治疗分子的抗癌活性的方法，其特征在于其包括：

-在含胚鸟卵的绒毛尿囊膜(CAM)水平上移植肿瘤细胞，所述含胚鸟卵在移植时已预先孵育到与CAM形成相对应且相当于在鸡中至少8天的发育阶段；

-移植至少12小时后，将免疫治疗分子施用至所述含胚卵中，

-研究施用的所述免疫治疗分子对移植胚胎中发展的肿瘤的肿瘤发生的作用，

并且其是在不存在且没有添加除移植卵的免疫效应细胞以外的免疫效应细胞的情况下实施的。

本领域技术人员将能够根据所用鸟的物种确定移植肿瘤细胞的时间，即孵育或发育含胚卵以达到CAM形成的最小天数，且达到相当于在鸡中发育至少8天的发育阶段。例如，在鸡中，移植可以从发育8天起发生，而在鹌鹑中可以从发育6.5天起发生。

根据一个优选的实施方案，在移植之前，将所述含胚卵孵育至与CAM形成对应的发育阶段，且相当于在鸡中发育至少9天或甚至更优选9.5天。

孵育在适当的条件下进行，即允许含胚卵正常发育的条件，尤其是在37℃至39℃之间的温度下，优选在38℃或甚至38.5℃的温度下。

可以在上部或下部CAM的任何位置进行移植肿瘤细胞，优选在上部CAM的水平上进行。本领域技术人员公知的任何方法都可以用于所述移植，特别是可以使用参考Crespo P.和Casar B.(2016)的移植技术。

根据一个特定的实施方案，移植的肿瘤细胞的量为从约10个细胞至约5×10

根据一个优选的实施方案，对于细胞系或对于从癌症患者或动物样品中分离的肿瘤细胞，所用的肿瘤细胞在移植至含胚卵中之前被冷冻。

特别地，当移植的肿瘤细胞是源自患有癌症的患者或动物样品时，测试多种免疫治疗分子使得可以选择对该患者或动物的肿瘤治疗最有前景的免疫治疗分子。因此，根据本发明的一个优选的实施方案，所述评估一种或多种免疫治疗分子的抗癌活性的方法允许确定在所测试的不同分子中表现出最佳抗癌活性的免疫治疗分子。

所述根据本发明的评估一种或多种免疫治疗分子的抗癌活性的方法还使得可以测试免疫治疗分子的组合的抗癌有效性，相对于由每种独立测试的免疫治疗分子获得的效果。

可以通过本领域技术人员众所周知的技术，以不同的方式来进行将免疫治疗分子施用至含胚卵中的步骤。所述施用尤其可以通过在CAM水平上附着或注射、通过肿瘤内注射、通过注射到卵的胚胎或胚外结构中来进行。

所述免疫治疗分子的施用在移植肿瘤细胞后至少12小时进行，优选至少24小时，甚至更优选在移植后至少48小时，即在移植后1至2天进行。所述免疫治疗分子可以根据在持续时间方面的不同模式施用，也可以根据施用次数方面的不同模式施用，例如每隔一天、或每天、或每天两次、或单次注射，直至孵育卵的最后一天。所述选择将由所施用的免疫治疗分子确定。

根据一个优选的实施方案，根据本发明的评估一种或多种免疫治疗分子的抗癌活性的方法，进一步包括在将免疫治疗分子施用至移植的含胚卵中后，研究其对肿瘤发生的作用之前，将移植后的含胚卵孵育至少1小时。有利地，所述孵育进行至少4天且至多12天，以对应于发育至多21天、有利地为18天的胚胎发育阶段。

根据一个特定的实施方案，根据本发明的评估一种或多种免疫治疗分子的抗癌活性的方法，进一步包括在施用已被施用的免疫治疗分子后，在所述含胚卵的孵育结束时，收集从移植的肿瘤细胞发展而来的肿瘤，尤其是通过显微解剖。

研究施用的所述免疫治疗分子对肿瘤发生的作用可以采取几种互补的方法，特别是在收集移植胚胎中发展的肿瘤之后。其尤其可以包括分析参数，例如肿瘤生长、转移性侵袭、血管生成、新生血管形成、炎症和/或肿瘤免疫浸润和肿瘤毒性。

因此，可以对肿瘤进行分析以测量和/或分析这些不同的参数，例如肿瘤的重量和/或体积以研究肿瘤生长，不同的特异性标记物的表达以研究转移性侵袭(例如通过定量PCR进行Alu序列扩增以研究人转移)，肿瘤中的血管数量以研究血管生成和新生血管形成，白细胞介素的定量以研究炎症，和/或标记物的定量，尤其是通过rtQPCR定量，所述标记物例如CD3、CD8、CD4、CD45和CD56，以评定肿瘤免疫浸润、重量和组织学分析，以评估对肿瘤的毒性。

转移性侵袭的研究可以在易于接触到的下部CAM上进行，但也可以在胚胎内的任何靶器官中进行，特别是取决于癌症的类型和有关转移现象的已知数据。

炎症和/或肿瘤免疫浸润尤其可以通过分析不同标志物的表达来研究，例如CD3(T淋巴细胞的膜标志物)、CD4(调节性T淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞的膜标志物)、CD8(细胞毒性T淋巴细胞的标志物)、CD45(白细胞的膜标志物)、CD56(NK细胞的标志物)等。可以开发对这些标志物具有特异性的寡核苷酸对，以避免物种间的杂交。

通过扩展，还可能在转移部位监测炎症和免疫系统细胞的浸润。

所有这些因素的组合分析是本领域技术人员众所周知的，且使得可以确定在胚胎中施用的免疫治疗分子的抗癌有效性。这些参数尤其是决策树不可或缺的一部分，所述决策树被临床医生用于决定将在癌症患者中采用的治疗方法。

在包括研究免疫治疗分子对肿瘤发生作用的本发明所有方法的范围内，所述抗癌活性优选通过以下评估：比较将免疫治疗分子施用至移植后的含胚卵后收集的肿瘤的肿瘤发生与从之前已根据相同方法移植了相同肿瘤细胞、而未施用免疫治疗分子的同一鸟的另一个含胚卵中收集的肿瘤的肿瘤发生。类似地，当研究几种免疫治疗分子的作用时，将优先通过以下评估抗癌活性：比较将免疫治疗分子的组合施用至移植后的含胚卵后收集的肿瘤的肿瘤发生与从之前已根据相同方法移植了相同肿瘤细胞、但其中单独施用了每种免疫治疗分子的同一鸟的另一个或多个含胚卵中收集的肿瘤的肿瘤发生。

有利地，在根据本发明的评估抗癌活性的方法的范围内，评估的是一种或多种免疫检查点抑制剂的抗癌活性，并且优选抗PD1抗体或抗PDL1抗体的抗癌活性。

本发明还涉及一种筛选用于体内癌症治疗的免疫治疗分子的方法。因此，根据另一个方面，本发明涉及一种筛选具有抗癌活性的免疫治疗分子的方法，其包括以下步骤：

-在含胚鸟卵的绒毛尿囊膜(CAM)水平上移植肿瘤细胞，所述含胚鸟卵预先孵育到与CAM形成相对应且相当于在鸡中至少发育8天的发育阶段，

-移植至少12小时后，将候选免疫治疗分子施用至所述含胚卵中，

-研究施用的所述免疫治疗分子对移植的含胚卵中发展的肿瘤的肿瘤发生的作用，

所述方法是在不存在且没有添加除移植卵的免疫效应细胞以外的免疫效应细胞的情况下实施的。

“候选免疫治疗分子”是指如上定义的化学或生物学免疫治疗分子，其可能具有抗肿瘤/抗癌活性，并且特别地在治疗从移植至含胚卵中的肿瘤细胞发展而来的类型的癌症中具有潜在效果。

根据本发明的筛选方法允许确定候选治疗剂是否具有抗癌活性，以及其是否具有抗转移活性。

根据另一个方面，本发明还涉及一种监测患有癌症的患者或动物的方法，其包括：

-用来自所述患者或动物在时间T1的肿瘤细胞制备如上所述的第一含胚鸟卵，并研究在所述第一含胚卵中发展的肿瘤的肿瘤发生，

-用来自同一患者或动物在时间T2的肿瘤细胞制备如上所述的第二含胚鸟卵，并研究在所述第二含胚卵中发展的肿瘤的肿瘤发生，

-比较在所述第一和第二含胚卵中发展的肿瘤的肿瘤发生，

所述方法是在不存在且没有添加除移植卵的免疫效应细胞以外的免疫效应细胞的情况下实施的。

所有上述评估免疫治疗分子的抗癌活性的方法的优选和细节均在细节上作必要的修改后适用于本发明的监测和筛选方法。

在下文中，通过使用具有在绒毛尿囊膜(CAM)上发展的人起源的肿瘤的母鸡卵来说明本发明，以验证不同的免疫治疗分子在肿瘤学中的有效性，特别是验证针对两种膜蛋白的抗体的有效性，所述两种膜蛋白在免疫系统与肿瘤的相互作用中具有主要作用：PD-1和PDL-1。

PD-1(或程序性细胞死亡蛋白1，PDC1)是一种在活化T淋巴细胞表面表达的膜蛋白。其与存在于肿瘤细胞表面的其配体PDL-1(程序性细胞死亡配体1)结合，导致针对肿瘤细胞的T淋巴细胞失活(抑制增殖和细胞因子分泌)。

免疫检查点抑制剂的开发旨在消除阻碍淋巴细胞并防止其攻击肿瘤的障碍。因此，抗PD1或抗PD-L1抗体应重新激活免疫系统对肿瘤的攻击。

胚胎、孵育条件和移植

打开含胚卵并在绒毛尿囊膜(CAM)上通过附着移植肿瘤细胞是已知的，并且多年来被广泛报道(Crespo P.和Casar B.,2016)。肿瘤细胞移植位点在上部CAM上的含胚卵示意图示于图1。

此处仅描述用于本验证研究的特定条件：

-受精母鸡卵平放在37℃和40％湿度下孵育9.5天。

-在发育E9.5时，打开卵，同时保持CAM的完整性。打开后将细胞移植至CAM上，然后将卵在37℃和40％湿度下再孵育24小时。

-对于每个组(对照组和治疗组)，至少给出9个卵(在E18时存活的卵)的结果。

细胞系

标准淋巴瘤(SU-DHL-4)、乳腺腺癌(MDA-MB-231)或胶质母细胞瘤(U87)细胞系以表1所述的数量和条件进行移植。

表1

免疫治疗分子

移植后，使用抗人PD1或抗PDL1抗体处理卵内肿瘤，在四个时期(E10.5；E12.5；E14.5；E16.5)使用100μL不同浓度的抗体处理(抗PD1或抗PDL1)(详见下图)。

测试的抗PD1和抗PDL-1抗体列于表2。

表2

阿特朱单抗(抗PD-L1，特善奇)和派姆单抗(抗PD-1，可瑞达)是已在人体中处方的两种单克隆抗体。

阿特朱单抗(抗PD-L1，特善奇)是第一个被批准用于人的抗PDL-1(FDA)。其用于针对转移性非小细胞肺癌。其还可用于针对尿路上皮癌。派姆单抗(抗PD-1，可瑞达)是针对多种癌症(黑色素瘤、肺癌、霍奇金淋巴瘤、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌等)处方的抗PD-1，是纳武单抗(欧狄沃)的商业竞争者，纳武单抗也是抗PD-1但结合PD-1膜蛋白上的另一位点(Fessas,P.；Semin Oncol.2017)。

肿瘤采集与分析

在E18时，打开卵，收集肿瘤，将其固定在4％多聚甲醛中，在磷酸盐缓冲液(PBS)中清洗去除肿瘤周围的CAM碎片，然后在精密天平上称重。为了进行转移分析，可以收集并冷冻一块下部CAM(与移植位点相对)。将其用于总基因组DNA提取。这些样品中的人细胞检测通过qPCR进行，其使用针对人Alu序列(在人中非常保守的多拷贝序列)的特异性引物(Zijlstra,A.等人，2012)。

图2表示从细胞移植至样品收集的研究时间表。

在不同的癌症模型中获得了结果，证明了这种处理在多种模型中的潜力。

1.四种免疫疗法对肿瘤生长的有效性

细胞移植后，用100μL阿特朱单抗(抗PDL-1，特善奇)以每个卵4μg/kg的剂量处理肿瘤4次(E10.5；E12.5；E14.5；E16.5)。

在施用阿特朱单抗后，起源于MDA-MB-231细胞的肿瘤重量分析结果汇总于表3中(SD：标准差；SEM：均值的标准误差)和附图3中。

表3

细胞移植后，用100μL派姆单抗(抗PD-1，可瑞达)处理肿瘤4次(E10.5；E12.5；E14.5；E16.5)。

在施用派姆单抗后，起源于MDA-MB-231细胞或SU-DHL-4细胞的肿瘤重量分析结果汇总于表4和表5中(SD：标准差；SEM：均值的标准误差)和附图4中。

表4

表5

细胞移植后，用100μL RMP1-14(鼠抗PDL-1)以每个卵166μg/kg的浓度处理肿瘤4次(E10.5；E12.5；E14.5；E16.5)。

在施用RMP1-14后，起源于SU-DHL-4细胞的肿瘤重量分析结果汇总于表6中(SD：标准差；SEM：均值的标准误差)和附图5中。

表6

细胞移植后，用100μL纳武单抗(抗PD-1，欧狄沃)处理肿瘤4次(E10.5；E12.5；E14.5；E16.5)。

在施用纳武单抗后，起源于MDA-MB-231细胞的肿瘤重量分析结果汇总于表7中(SD：标准差；SEM：均值的标准误差)和附图6中。

表7

2.监测转移性侵袭

除肿瘤重量外，还可以在施用免疫治疗后监测含胚卵内的转移性侵袭。

此分析通常使用从胚胎或下部CAM的任何组织提取的基因组DNA(MagJET基因组DNA试剂盒；ThermoScientific；Ref.K2721)，通过qPCR(Bio-Rad；SsoAdvanced Univ SYBRGreen Supermix Ref.1725274)进行，并使用对人Alu序列(人基因组中的多拷贝序列)具有特异性的寡核苷酸(Zijlstra，A.等人，2012)。

如上所述移植MDA-MB-231细胞、然后施用派姆单抗(抗PD-1，可瑞达)后，本文在从一块下部CAM(一种容易获得的组织)中提取的基因组DNA上进行了分析。

结果汇总于附图7中。

3.免疫系统细胞对肿瘤浸润的分析

除了观察到的对肿瘤重量的有效性之外，进一步可以通过在存在或不存在免疫疗法的情况下测量免疫细胞从胚胎向肿瘤组织中的浸润，来分析免疫疗法的作用。

如上所述，在施用或不施用抗PD-1派姆单抗或纳武单抗、或抗PD-L1阿特朱单抗之后，通过qPCR在起源于SU-DHL-4细胞的肿瘤中分析了标志物的表达，所述标志物为禽形式的CD3(T淋巴细胞膜标志物)、CD4(调节性T淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞的膜标志物)、CD45(白细胞膜标志物)、CD8(细胞毒性T淋巴细胞标志物)和CD56(NK细胞标志物)。

收集组织，提取总RNA(MagJET RNA试剂盒；ThermoScientific；Ref.K2731)。从总RNA中合成cDNA(iScript Explore RT和PreAmp试剂盒；Bio-Rad；Ref.12004856)，针对所寻找的每种生物标志物进行了特异性的预扩增(PrimePCR，Pre-Amp试验，鸡探针；Bio-Rad；Ref.10041596)。然后用对每种生物标志物具有特异性的寡核苷酸进行定量PCR(PrimePCRFAM试验，鸡；Bio-Rad；Ref.12001961)。

结果汇总于图8(抗PDL-1，阿特朱单抗)、图9(抗PD-1，派姆单抗)和图10(抗PD-1，纳武单抗)中，并显示了经过或未经过阿特朱单抗(抗PDL-1)、派姆单抗(抗PD-1)或纳武单抗(抗PD-1)的免疫疗法处理后携带CD3、CD4、CD45、CD8和CD56的鸡免疫细胞的浸润。

4.鸡胚免疫细胞的表征及其对免疫治疗的响应

在E16时收集鸡外周血。外周血单个核细胞(PBMC)通过

结果汇总于图11中，表明在鸡胚外周血中检测到不同的免疫细胞群(CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和单核细胞)，揭示了鸡胚免疫系统是有功能的。

如上所述的在E16收集的血液中的外周血单个核细胞(PBMC)用植物血凝素(PHA，Sigma-11249738001，5μg/mL)活化72小时。然后，将派姆单抗(可瑞达

结果汇总于图12中，证明了用派姆单抗处理T淋巴细胞后，鸡T淋巴细胞对人H460肿瘤细胞的细胞毒性作用增加。

当肿瘤细胞与经过派姆单抗处理的T淋巴细胞一起孵育时，与未经过派姆单抗处理的T淋巴细胞与肿瘤细胞的孵育相比，检测到更大的肿瘤细胞生存力。这种差异表示T淋巴细胞的细胞毒性增加，表明派姆单抗有效阻断了鸡T淋巴细胞上的PD-1。

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