Cyr61在增生性瘢痕及正常皮肤中的差异表达及意义

摘要

目的：
　　 于组织水平和细胞水平观察Cyr61(cysteine-rich61)在增生性瘢痕及正常皮肤中的表达差异，并探讨Cyr61在增生性瘢痕形成过程中的意义，为进一步研究其作用的信号通路提供实验基础，为防治增生性瘢痕提供新的理论依据和药物作用靶点。
　　 方法：
　　 1．增生性瘢痕及正常皮肤标本的选取临床上收集手术切除的人增生性瘢痕和正常皮肤组织，其中增生性瘢痕8例，增生性瘢痕患者在取材前未经任何药物治疗，自身不伴有肿瘤或其他严重疾患；正常皮肤8例，其中5例增生性瘢痕和正常皮肤来自同一病人。
　　 2．免疫组化检测Cyr61蛋白表达通过免疫组化检测Cyr61蛋白在增生性瘢痕及正常皮肤中的表达及分布情况，采用二步法对两组组织切片进行染色，于40×10倍光镜下观察，每张片子选择染色均匀的区域，取五个视野拍摄保存，拍摄前设置白平衡、快门时间等参数一致。将所拍照片导入Image-ProPlus6.0软件，通过对图片阳性表达的累积光密度值(IntegrateOpticaldensity，IOD)进行测量，将其作为评价Cyr61蛋白表达的指标。
　　 3．原代细胞培养及增殖曲线检测取3例来自同一病人的增生性瘢痕(hypertrophicscar,HS)及对应的正常皮肤(normalskin，NS)作原代细胞培养，将3例增生性瘢痕培养出来的细胞归为HS组，3例正常皮肤培养出来的细胞归为NS组。并取其中1例增生性瘢痕及对应的正常皮肤成纤维细胞，采用甲基噻唑基四唑(Methylthiazolyltetrazolium,MTT)法分别于培养后12h、24h、36h、48h、72h、96h测定其光吸收值，作两种细胞的自然增殖曲线。
　　 4．定量实时反转录聚合酶链反应检测Cyr61基因的表达将处于对数生长期的增生性瘢痕成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞，以3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)为内参照，做定量实时反转录聚合酶链反应(Quantitativereal-timereversetranscriptionpolymerasechainreaction，qRT-PCR)检测，每例细胞做3次重复，采用相对定量法，以2-△Ct表示目的基因相对于内参的相对表达量，其中△Ct=CtCyr61-CtGAPDH，于基因水平检测Cyr61mRNA在两组细胞中的表达。
　　 5．细胞免疫化学法检测Cyr61蛋白的表达取处于对数生长期的增生性瘢痕成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞，行细胞免疫荧光法，每例细胞做3次重复，并利用激光共聚焦显微镜观察Cyr61在两种细胞中的表达定位，调整发射光波长495nm，激发光波长488nm，于10×10倍光镜下选择染色均匀的区域，取五个视野拍摄保存，将所拍照片导入Image-ProPlus6.0软件，通过对图片阳性表达的累积光密度进行测量，将其作为评价Cyr61蛋白在两组细胞中表达的指标。
　　 结果：
　　 1．免疫组化检测Cyr61蛋白表达增生性瘢痕组织及正常皮肤组织的表皮层和真皮层中，均能发现Cyr61蛋白表达，免疫组化结果通过Image-ProPlus6.0计算，得出Cyr61在增生性瘢痕组和正常皮肤组表达的累积光密度值(IOD)分别为85.85±11.52和44.50±8.16。经过统计学分析，HS组及NS组IOD比较有统计学意义(P＜0.05)。
　　 2．原代细胞培养及增殖曲线检测体外培养的增生性瘢痕及正常皮肤成纤维细胞镜下形态观察为梭形，胞浆丰富胞体较大，两种细胞形态上无明显差别。MTT法检测接种12h，24h，36h，48h，72h，96h后增生性瘢痕成纤维细胞平均OD值为分别为(0.16±0.01，0.20±0.01,0.24±0.02,0.24±0.04,0.18±0.05,0.16±0.03)，正常皮肤成纤维细胞平均OD值分别为(0.14±0.01，0.18±0.01，0.24±0.02，0.27±0.02，0.22±0.02，0.16±0.02)绘制细胞自然增殖曲线表明两种细胞均为稳定型成纤维细胞，可以满足后续的实验需要；
　　 3．RT-PCR检测Cyr61基因的表达对正常皮肤成纤维细胞及增生性瘢痕成纤维细胞进行qRT-PCR法检测Cyr61mRNA的表达情况，通过计算△Ct值，3例正常皮肤成纤维细胞平均△Ct分别为2.88±0.26，2.25±0.27，2.46±0.22，3例增生性瘢痕成纤维细胞平均△Ct分别为3.81±0.17，3.92±0.12，3.36±0.22，经统计学分析，两组结果比较有统计学意义(p＜0.05)。
　　 4．细胞免疫荧光法检测Cyr61蛋白的表达
　　 细胞免疫荧光法检测后显示Cyr61在增生性瘢痕成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞均有表达，应用Image-ProPlus6.0软件分析免疫荧光图后，得出Cyr61在增生性瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞表达的累积光密度值(IOD)分别为(0.040±0.002，0.046±0.001，0.055±0.001)和(0.016±0.001，0.017±0.000，0.013±0.000)。经过统计学分析，Cyr61在增生性瘢痕成纤维细胞中显示的光密度要高于正常皮肤成纤维细胞(P＜0.05)。
　　 结论：
　　 在蛋白水平及基因水平，Cyr61在增生性瘢痕中的表达高于正常皮肤，这结果表明Cyr61可能参与了增生性瘢痕形成的机制。它可能通过调节胶原代谢、调节成纤维细胞增殖以及调节成纤维细胞衰老并分泌抗纤维化因子影响增生性瘢痕的形成。