遗传性纤维蛋白原缺陷症和遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症的分子发病机制研究

摘要

遗传性凝血因子缺陷症是一类单基因遗传病，其发病率虽低，但极大的危害了患者本人及其后代。通过对该类遗传病进行分子机制研究，有助于了解凝血因子结构与功能的关系，为出血或血栓性疾病的诊断及治疗提供理论依据，且对降低该类疾病的发病率有重要的意义。本课题对2例遗传性低纤维蛋白原血症患者和1例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者进行了表型诊断和基因分析，初步探讨其发病机制。 一、遗传性纤维蛋白原缺陷症的研究 目的 纤维蛋白原(Fg)主要是作为凝血因子Ⅰ而直接参与凝血过程，是凝血途径中一个非常重要的部分。遗传性低纤维蛋白原血症大多为常染色体隐性遗传病，患者出血症状少且轻微甚至不出血，仅在外伤、手术时可发生出血倾向。自1935年首次报道以来，文献中报道该病共约80例，低纤维蛋白原血症的患者大多是引起无纤维蛋白原血症突变的杂合突变携带者。据Fg突变数据库最新统计，引起遗传性低纤维蛋白原血症的突变有60多种，主要包括启动子、剪切位点、无义、错义、缺失和小的插入等6种突变，其中错义突变约有37种，而发生在γ链上的约有23种。本研究通过对2例遗传性低纤维蛋白原血症患者及家系进行表型和基因分析，探讨其发病机制。 材料和方法 (一)研究对象 1、家系1：先证者，女，6岁。因扁桃体清除术前检查时发现活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)均延长，Fg活性和抗原均明显降低。无肝肾功能障碍。父母为非近亲结婚。 2、家系2：先证者，男，20岁。因“中耳炎”行术前检查时发现PT和TT均延长，Fg活性和抗原均明显降低。无肝肾功能障碍。先证者母亲的PT、TT也有延长；Fg活性和抗原均明显降低。父母为非近亲结婚。 3、正常对照：150例，男82例，女68例，平均年龄34(18～60)岁，均为我院健康体检者。对照组均无肝肾功能疾病，无出血或血栓史，采样前已征得本人同意。 (二)方法 STAGO-STA-R全自动血凝仪检测患者APTT、PT、TT。Clauss法和免疫比浊法分别检测患者Fg活性和抗原(抗原由上海交通大学附属瑞金医院血栓与止血实验室检测)。根据Genbank序列M64982、AF229198、M64983、X05018和M10014应用Primer Premier5.0软件设计引物覆盖Fg基因的所有外显子区域及其侧翼序列。PCR反应在扩增仪(ABI Therml cycler2720，USA)上进行，PCR扩增产物送上海桑尼生物科技有限公司，在ABI3730XL测序仪上采用双脱氧链终止法进行测序，用Chromas软件将测序结果与美国国立生物信息中心(NCBI)所公布的相应序列进行在线比对(Blast)，以寻找基因突变。 结果 1、家系1： 先证者的APTT、PT和TT均有延长，分别为45.3s、19.9s和31.7s；纤维蛋白原活性和抗原均明显降低，分别为0.60g/L和0.90 g/L；其父母均正常。基因分析显示先证者纤维蛋白原FGG基因8号外显子g.7598G>C杂合碱基改变(密码子GAC>CAC)，导致Asp316His错义突变，父母均未发现该突变。 2、家系2： 先证者的PT、TT均有延长，分别为16.1 s和25.6s；Fg活性和抗原均明显降低，分别为0.73g/L和0.80 g/L；先证者母亲的PT、TT也有延长；Fg活性和抗原均明显降低。基因分析显示先证者和母亲纤维蛋白原FGG基因7号外显子g.5792G>T杂合碱基改变(密码子TGG>TTG)，导致Trp208Leu错义突变，父亲未发现该突变。 结论 1、通过数据库(http：//www.geht.org/databaseang/fibrinogen)查询，本研究中发现的两个点突变Asp316His和Trp208Leu均为目前鲜见报道的新的基因突变。 2、杂合Asp316His错义突变是引起患者1低纤维蛋白原血症的重要原因。而杂合Trp208Leu错义突变是导致患者2及母亲发生低纤维蛋白原血症的重要原因。 3、Asp316His和Trp208Leu错义突变均引起氨基酸改变，可能影响D区结构和功能，损伤了Fg组装和(或)释放，但是其具体机制有待于进一步研究。 二、遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症的研究 目的 凝血因子Ⅶ(FⅦ)是由肝脏合成并分泌的一种呈维生素K依赖性的单链糖蛋白，参与外源性凝血途径。遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症是一种常染色体隐性遗传病，该病可引起血浆中FⅦ促凝活性降低，临床表现为不同程度的出血倾向。本研究通过对1例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者进行表型和基因分析，探讨该患者的发病机制。 材料和方法 (一)研究对象 患者为女性，72岁，因“胆结石，肝囊肿”住院准备手术，术前检查，发现PT延长，FⅦ活性(FⅦ：C)和FⅦ抗原(FⅦ：Ag)明显降低。既往无明显出血史。 (二)方法 STAGO-STA-R全自动血凝仪检测APTT、PT、TT、Fg、FⅡ活性(FⅡ：C)、FⅤ活性(FⅤ：C)、FⅦ：C、FⅩ活性(FⅩ：C)。采用ELISA双抗体夹心法检测FⅦ：Ag(由上海交通大学附属瑞金医院代为检测)。根据FⅦ基因序列(GenBankJ02933)应用Primer Premier5.0软件共设计10对引物以覆盖FⅦ基因的所有外显子区域及其侧翼序列。进行PCR反应和测序，寻找基因突变。 结果 表型检测发现患者PT延长为26.5s，FⅦ：C和FⅦ：Ag明显降低，分别为6.0%和2.1%。基因分析发现发现患者外显子1a上存在一个缺失突变(27delCT)。 结论 该缺失突变(27delCT)在国际上已有报道，可引起读码框移位，导致终止密码子提前出现，产生截短蛋白，因此，27delCT是导致该患者发病的重要原因。