垂体腺苷酸环化酶激活肽与哮喘小鼠气道炎症及其对NF--κBp65的干预作用

摘要

目的：(1)观察哮喘小鼠肺组织中垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP38)的表达情况；(2)应用PAC1R(PACAP38的特异性受体)阻滞剂PACAP6-38，探讨PACAP38对哮喘小鼠炎性介质胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、IL-6的影响及其可能机制；(3)观察核因子Nuclear factor k appaBp65(NF-k Bp65)在哮喘小鼠肺组织中的表达及PACAP38对它的影响。 方法：建立小鼠卵白蛋白(OVA)致敏和激发的哮喘模型。60只SPF级雄性BALB/c小鼠(3-5周)，随机分为六组，每组10只：A组(溶剂对照组)、B组(哮喘模型组)、C组(地塞米松组)、D组(PACAP38组)、E组(PACAP6-38组)、F组(PACAP38+PACAP6-38组)。A组用生理盐水，剩余组于第1天和第13天腹腔注射0.1ml含0.01％OVA+Al(0H)3凝胶混合致敏；第25天开始予1％OVA生理盐水溶液激发，每天1次，每次30分钟，连续8天。每日上午激发前30分钟C、D、E组分别腹腔注射地塞米松溶液(0.5mg/kg)、PACAP38溶液(1×10-4g/kg)、PACAP6-38溶液(1×10-4g/kg)干预；F组先注射PACAP6-38溶液，5分钟后注射PACAP38溶液，剂量同上述；A、B组以生理盐水代替。末次激发后24小时内处死小鼠，对支气管肺泡灌洗液(BALF)沉渣行白细胞总数计数，光镜观察肺组织病理改变；检测A、B组小鼠血清、BALF、肺组织中PACAP38的含量；固相夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组小鼠血清、BALF中IL-4、IFN-γ的浓度，免疫组化、逆转录多聚酶联反应(RT-PCR)检测NF-k Bp65、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、IL-6、IL-4、IFN-γ的表达情况等。 结果：1.各组小鼠BALF中白细胞总数计数的比较：BALF中白细胞总数计数B组[(36.50±5.30)×107个/L]明显高于A组[(5.50±4.38)×107个/L](P<0.01)；C组[(27.22±5.65)×107个/L]、D组[(26.00±8.10)×107个/L]均低于B组(P<0.01)；E组[(36.50±5.80)×107个/L]；F组[(34.50+7.25)×107个/L]与B组比较无明显差异(P>0.05)。 2.光镜下肺组织病理改变：小鼠肺组织HE染色B组可见细支气管及血管周围有大量炎性细胞浸润，其中以嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和中性粒细胞为主，粘膜上皮脱落甚至断裂，基底膜平滑肌轻度增厚，肺间质及细支气管腔内可见炎性细胞及黏液渗出；C组、D组肺血管及支气管周围炎性细胞浸润等病理改变较B组轻；E组、F组支气管周围可见较多炎性细胞，类似于B组。A组支气管、血管周围无炎性细胞浸润，粘膜上皮完整。 3.A、B组血清、BALF及肺组织中PACAP38mRNA表达：B组肺组织中PACAP38mRNA表达(0.05±0.01)低于A组(0.13±0.01)(P<0.05)；血清及BALF中PACAP38浓度[分别为(23.31±8.69)pg/ml、(5.49±1.98)pg/ml]均较A组高[分别为(5.82±2.53)pg/ml、(1.72±0.37)pg/ml](P<0.01或P<0.05)； 4.免疫组化、RT-PCR检测IL-6表达结果：肺组织中IL-6蛋白浓度及IL-6mRNA表达，B组[分别为(0.06±0.03)、(0.15±0.02)]显著高于A组[分别为(0.01±0.01)、(0.05±0.01)](P<0.01)；C组[分别为(0.03±0.01)、(0.06±0.02)]、D组[分别为(0.03±0.01)、(0.06±0.02)]均显著低于B组(P<0.01)；E组[分别为(0.06±0.02)、(0.16±0.02)]、F组[分别为(0.05±0.01)、(0.15±0.02)]与B组比较无显著差异(P>0.05)。 5.免疫组化、RT-PCR检测TSLP表达结果：B组肺组织TSLP蛋白浓度(0.07±0.02)及TSLPmRNA含量(0.73±0.12)均较A组高[分别为(0.01±0.00)、(0.21±0.03)](P<0.01)；C组[分别为(0.02±0.01)、(0.38±0.12)]、D组[分别为(0.03±0.01)、(0.33±0.11)]均较B组低(P<0.01)；E组[分别为(0.07±0.02)、(0.65±0.14)]、F组[分别为(0.07±0.01)、(0.62±0.11)]与B组比较无显著差异(P>0.05)。 6.各组小鼠肺组织NF-k Bp65的表达情况：B组NF-k Bp65表达(0.05±0.01)显著高于A组(0.01±0.00)(P<0.01)；C组(0.02±0.00)、D组(0.02±0.00)显著低于B组(P<0.01)；E组(0.05±0.00)、F组(0.05±0.01)与B组比较无显著差异(P>0.05)。 7.相关性分析：(1)小鼠肺组织中TSLPmRNA表达与BALF中白细胞总数、IL-6mRNA表达成正相关；与血清中IFN-γ/IL-4浓度比值成负相关；(2)小鼠肺组织中IL-6mRNA表达与BALF中白细胞总数成正相关；与血清中IFN-γ/IL-4浓度比值成负相关；(3)小鼠肺组织中NF-k Bp65的表达与BALF中白细胞总数、肺组织中TSLPmRNA、IL-6蛋白表达成正相关，与血清中IFN-γ/IL4浓度比值呈负相关。 结论：1.哮喘小鼠肺组织中PACAP38表达不足； 2.哮喘小鼠肺组织中TSLP、IL-6蛋白表达增加，PACAP38通过与PAC1R结合，抑制TSLP、IL-6的水平； 3.PACAP38主要通过抑制NF-k Bp65的表达发挥其抗炎作用。