Rho/Rho激酶在哮喘小鼠气道炎症和气道高反应中的作用及干预

摘要

目的：探讨RhoA／ROCK信号通路在哮喘小鼠发病机制中的作用及其调控。(1)建立过敏性哮喘小鼠模型并观察模型RhoAmRNA、ROCKII蛋白及ROCKIImRNA表达情况。(2)探讨Rho／ROCK信号通路与气道炎症、气道高反应性及气道重塑的关系。(3)研究ROCKII阻滞剂Y-27632和川芎嗪对气道炎症、气道高反应性及气道重塑和肺组织RhoA、ROCKII表达的影响。(4)观察地塞米松对气道重塑和肺组织RhoA、ROCKII表达的影响。 方法：雄性BALB／C小鼠49只，4-6周，随机分为五组，每组10只(其中A组9只)：A组(正常对照组)，B组(哮喘模型组)，C组(川芎嗪干预组)，D组(地塞米松干预组)，E组(Y-27632干预组)。正常组用生理盐水，模型组及各干预组用OVA／A1(OH)3混合凝胶于第1、14天腹腔注射(i．p)致敏，第25天开始激发，每日一次，每次30分钟，连续7天。激发前半小时，C组予腹腔注射川芎嗪(80mg／kg)、D组予地塞米松(0．5mg／kg)、E组予ROCKH阻滞剂Y-27632(4mg／kg)干预，其余两组以生理盐水代替。末次激发后24小时检测小鼠气道高反应性，处死小鼠用固相夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测血清及BALF液中肿瘤坏死因子-Q(TNF-Q)水平，对BALF液行细胞总数计数，BALF液沉渣涂片作细胞分类计数，外周血涂片细胞分类计数，肺组织作病理检测观察肺组织结构、气道平滑肌厚度和气管壁厚度变化及超微结构变化，免疫组化、RT-PCR法测Rho／ROCK信号通路关键分子的表达情况等。 结果： 1. 细胞计数及分类计数：B组BALF液细胞总数【(4．7+2．83)×10'／L】、嗜酸细胞百分比【(8．9+4．38)％】、外周血嗜酸细胞百分比【(5．60+2．80)％】均显著高于A组【分别为(0．38+0．52)×109/L、(0．n±0．33)％、0】(均P<0．01)；C组【分别为(3．22±2．73)×10'／L、(5．89±2．85)％、(3．78±1．99)％】、D组【分别为(2．4±1．35)×109／[,、(6．15+2．94)％、(3．10+2．23)％】、E组【分别为(3．87+2．95)×109／L、(5．51±3．86)％、(2．08±1．68)％1，均低于B组但高于A组(P<0．05或P<0．01。 2．光镜：小鼠肺组织切片HE染色A组支气管和血管周围未见炎性细胞浸润，细支气管平滑肌未出现增殖情况；B组可见支气管和血管周围炎性细胞浸润，以淋巴细胞、EOS和中性粒细胞为主，支气管上皮多处断裂，并有基底膜增厚和平滑肌肥大等表现。C组、D组、E组上述改变程度不一，均比B组轻，其中以D组最为轻微，接近于A组。 3．电镜：电镜下A组显示正常的肺泡隔和肺泡U型上皮细胞，支气管纤毛上皮排列整齐；B组肺泡隔明显增厚，炎症细胞增多，基底膜增厚，肺泡II型上皮细胞肿胀，出现板层小体及线粒体空泡现象，支气管上皮细胞纤毛排列稀疏；C组、D组、E组上述改变程度不一，均比B组轻，其中以D组最为轻微。 4．支气管壁厚度Ova0和平滑肌厚度OVam)：B组小鼠Wat【(79．765±15．219)μm2／μm]、Wam【(25．480±3．608)um2/μm】较对照组{Wat【(38．963±9．944)um2／μm]、Wam【(13．700±1．137)μm2／μm]}增加(P<0．01)，各干预组中C组{War[(69．098±9．435)μmZ／μm}、Wam[(22．025±3．724)μm2／μm】)、D组(Wat[(58．946±9．807)μm2／μm】、Wam【(18．645±2．709)μm2／pm】)、E组(Wat【(69．076±7．670)μm2／μm]、Wam【(21．699±5．962)μm2／u叫)均较哮喘组减低(P<0．05或P<0．01)，但比A组仍有所增加(P<0．01)。 5．各组小鼠气道反应性检测结果：B组小鼠气道阻力增加幅度和肺动态顺应性下降幅度明显高于对照组(P<0．01)，各哮喘干预组与哮喘组比较气道高反应性下降，但仍高于对照组，差异有显著统计学意义(P<0．01或P<0．05)。 6．血清、BALF液中TNF-α浓度：哮喘组血清TNT—Q浓度【(33．019-t-19．148)pg／ml】及BALF液TNF—Q含量【(322．7604-112．611)pg／ml】均较对照组高{分别为(【4．814±2．084)pg／m~】、【(94．867±32．507)pg／rd】)(P<0．05或P<0．01)，c组分别为{[(25．535±8．277)pg／ml】、[(194．662±100．040)pg／ml】)、D组分别为{【(13．000±5．754)pg／ml】、【(162．7424-40．148)pffn~】)和E组分别为{[(22．214±12．616)pg／m~】、[(212．414±115．952)pg／rd])均有所升高，但低于哮喘组(P<0．05或P<0．01)，各干预组间相比无显著性差异(P>0．05)。 7．免疫组化检测ROCKⅡ蛋白表达结果：哮喘组小鼠肺组织ROCKII蛋白表达(0．452±0．052)明显高于对照组(0．334±0．024)(P<0．01)，C组(0．40494-O．022)、D组(0．374±0．025)和E组(0．403±0．033)均有所升高，但低于哮喘组(P<0．05或P<0．01)。A组蛋白表达水平最低。 8．RT-PCR检测RhoA、ROCKⅡmRNA表达的结果：RhoA、ROCKIImRNA表达呈明显的一致性：B组[RhoAmRNA(5．007±1．219)、ROCKIImRNA(7．449±1．429)】均明显高于A组[RhoAmRNA(3．291±0．737)、ROCKⅡmRNA(2．715±0．733)】(P<0．05或P<0．01)，其余三组呈不同程度的升高，介于A组和B组之间(P<0．05或P<0．01)。 9．相关分析：(D肺组织中RhoAmRNA含量与TNF—Q浓度、气道管壁厚度及平滑肌厚度呈正相关。(2)肺组织中ROCKII蛋白及mRNA表达与TNF—Q浓度、BALF液细胞总数、气道管壁厚度及平滑肌厚度呈正相关，与PC25Raw和PCIsCydn呈负相关。(3)BALF及血清中细胞因子TNF-Q浓度与细胞总数、War、Wam成正相关，与PC25Raw和PCIsCdyn呈负相关。 结论： 1. 哮喘小鼠肺组织RhoA及ROCKII表达增多，其与气道炎症因子、气道壁厚度、气道平滑肌厚度呈正相关，ROCKII表达与PC25Raw和PCisCydn呈负相关。 2．ROCKII受体拮抗剂Y-27632能够降低AHR，下调RhoA、ROCKII的表达，减轻气道炎症，改善气道壁和气道平滑肌的增厚程度。 3．川芎嗪能改善哮喘小鼠气道炎症，减轻AHR，对抗气道壁和气道平滑肌的增殖。 4．糖皮质激素早期干预可以减轻哮喘小鼠AHR及气道壁和气道平滑肌的增殖程度，抑制Rho／ROCK信号通路的关键分子RhoA、ROCKII的表达，是其抗哮喘的机制之一。

目录

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材料与方法

结果

分析与讨论

结论

今后研究方向

参考文献

个人信息

致谢

综述小G蛋白Rho/ROCK信号转导通路与哮喘

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