金属硫蛋白对糖尿病心肌病保护作用的蛋白质组学研究

摘要

糖尿病心肌病是糖尿病患者主要的心血管并发症，也是糖尿病患者死亡的主要原因。在2型糖尿病人群既存在着心肌坏死，也存在较高数量的心肌细胞凋亡，这种现象同样也发生于STZ诱导的1型糖尿病鼠的心脏中。越来越多的证据表明，活性氧与活性氮引起的损伤在介导糖尿病心血管并发症的病理过程中起着重要的作用，活性氮的主要损伤作用是引起蛋白质的硝基化。从一定角度上，硝基化蛋白质的检测可以用来反映糖尿病心血管并发症的发生和发展。 MT是一种富含半胱氨酸、能结合金属离子的蛋白质。它是一种有效的、非特异性的抗氧化分子，能有效的清除自由基，而且研究发现MT能明显预防过氧亚硝酸基阴离子诱导的损伤。前期有研究发现，3-NT可作为过氧亚硝酸基阴离子诱导的硝化损伤的标记分子，金属硫蛋白能显著抑制3-NT的产生。 本研究从蛋白质组学角度，着重于蛋白质硝基化的变化，探讨不同病程的糖尿病小鼠心脏中蛋白质的硝基化改变。同时，借助金属硫蛋白及过氧化氢酶转基因小鼠研究金属硫蛋白的抗氧化作用对糖尿病心肌病的保护。鉴定发生硝基化的蛋白质，筛选关键目标蛋白质，深入研究其功能改变，为糖尿病心肌病的诊断、治疗提供借鉴。 实验中将FVB小鼠，金属硫蛋白转基因(MT-1、MT-15、MM)小鼠及过氧化氢酶转基因小鼠(MYCAT)，分为对照组及不同病程的糖尿病组(2周、4周、8周、16周)，采集心脏标本，进行了以下实验： 一、组织学观察：1、石蜡切片，HE染色及天狼星红染色。2、冰冻切片，检测超氧阴离子(O2-)。 二、糖尿病心肌病蛋白质硝基化研究：1、Western blot检测糖尿病小鼠心脏中硝基化蛋白质的表达情况。2、Western blot检测3-硝基酪氨酸(3-NT)在患糖尿病后不同病程(0周、2周、4周、8周、16周)的变化及金属硫蛋白对其变化的影响。3、二向电泳分离糖尿病小鼠心脏蛋白质，western blot确定硝基化蛋白质。4、与SDS-PAGE上对应找到1D-western及2D-western显示的硝基化蛋白质，胶内酶切，质谱鉴定。5、SCOT含量及活性变化。 三、糖尿病心肌病心脏蛋白质组学研究：比较FVB小鼠糖尿病后蛋白质表达的差异。 结果发现糖尿病心脏组织发生病理性改变，出现细胞核皱缩，胶原纤维增生。金属硫蛋白及过氧化氢酶可抑制纤维增生的发生。超氧阴离子检测结果显示，随糖尿病病程加剧，超氧阴离子生成增多，金属硫蛋白及过氧化氢酶可抑制超氧阴离子生成。对酪氨酸硝基化的研究发现，3-NT在糖尿病早期有增加趋势，糖尿病后期又恢复到起始状态。金属硫蛋白及过氧化氢酶可抑制3-NT的生成。经过质谱鉴定，确定发生硝基化的蛋白质为琥珀酰辅酶A：3-酮酰辅酶转移酶(SCOT)，发生硝基化后，其活性下降，表达量则有补偿性上升。随后用2-D分析了FVB不同糖尿病周期的蛋白质表达图谱，对存在差异的19个蛋白(9个蛋白质上调表达、10个下调表达)进行了质谱鉴别。 通过本实验可以得出以下结论：糖尿病能增加体内超氧阴离子的生成，通过使SCOT发生硝基化以降低其活性，引起病变。金属硫蛋白及过氧化氢酶降低体内氧化应激的产生，可通过抑制SCOT的硝基化起到对糖尿病心肌病的保护作用。