变形链球菌表面蛋白可变区重组质粒pEGFP-N1-SrV+免疫SD大鼠的实验研究

摘要

龋病是细菌感染性疾病。变形链球菌（变链菌，Mutans Streptococci, MS）是公认的最主要的致龋菌。表面蛋白（AgⅠ/Ⅱ，SLSpaP，P1，PAc等）是变链菌细胞壁的锚定蛋白，是其重要的毒力因子之一，在龋齿的发生发展过程中发挥重要作用。根据表面蛋白的线性结构大致可分为以下几个区域:信号肽区、A区、P区、V区（可变区）和C末端。有研究报道，利用表面蛋白全分子结构、A区、P区，或A、P区联合，构建的一系列防龋基因疫苗，经动物实验证实均具有一定防龋效果。可变区做为表面蛋白的重要结构域，经系列研究证实其具有黏附和凝集作用、富含T、B细胞表位、含有糖结合位点、可刺激单核细胞释放肿瘤坏死因子等功能，提示该区域可能与龋病的形成等有关，在免疫防龋方面具有一定的研究意义。
　　 课题组在前期实验中，以变链菌OMZ175表面蛋白V区基因序列(srv+)为模板，构建了真核载体重组质粒pEGFP-N1-SrV+，并经体外实验证实该质粒能在哺乳动物细胞293T内表达。本研究通过动物实验，将该重组质粒pEGFP-N1-SrV+，经不同途径免疫SD大鼠，检测目的基因在大鼠体内不同部位的原位表达和特异性抗体形成情况，同时观察该质粒免疫后对大鼠龋齿形成的影响。
　　 本研究分为以下三个实验。
　　 实验一:重组质粒pEGFP-N1-SrV+和空载体质粒pEGFP-N1的提纯和鉴定。
　　 重组质粒pEGFP-N1-SrV+和空载体质粒pEGFP-N1经质粒小量提取试剂盒提纯，限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后电泳鉴定，重组质粒显示两个酶切片段，分别为4.7kb和1.1kb，空载体质粒显示一个片段为4.7kb，分别与空载体质粒和插入的目的基因大小一致。通过质粒大量提取试剂盒提取足够量的质粒。紫外分光光度计检测光密度值（Optical Density，OD），提纯质粒OD260nm/OD280nm均在1.8左右，浓度较高。
　　 实验二:重组质粒pEGFP-N1-SrV+免疫SD大鼠后的原位表达。
　　 20只SD大鼠随机分为4组，重组质粒pEGFP-N1-SrV+经股四头肌肌肉注射和下颌下腺区皮下注射两种途径免疫大鼠，空载体质粒免疫做为对照组，采用免疫组化方法观察，结果在大鼠股四头肌、下颌下腺组织内均可见重组质粒的阳性表达。
　　 实验三:重组质粒pEGFP-N1-SrV+免疫SD大鼠后对龋齿的影响。
　　 24只SD大鼠，建立龋齿模型后，随机分为4组，免疫途径同实验二，空载体和无菌生理盐水肌肉注射免疫做为对照组，免疫剂量为100μg/只，2周后加强免疫一次，采用间接酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测，发现血清特异性IgG抗体和唾液特异性IgA抗体水平升高，均于首次免疫后第4周达到高峰;该时段各组间的抗体水平，实验组均显著高于对照组(P＜0.01);经下颌下腺区皮下注射后产生的IgA抗体水平显著高于肌肉注射组(P＜0.05)。采用Keyes龋齿计分法评估磨牙的患龋情况，实验组和对照组间的龋齿计分未见明显差异（P＞0.05）。实验过程中各组大鼠体重变化无差异(P＞0.05)，重要脏器组织经HE染色未发现明显的病理改变。
　　 研究结果表明:1.重组质粒pEGFP-N1-SrV+经肌肉注射和下颌下腺区皮下注射免疫后能够在SD大鼠体内表达。2.重组质粒pEGFP-N1-SrV+经两种途径免疫后，能够诱导血清特异性IgG抗体和唾液IgA抗体产生。本研究证实了变链菌表面蛋白可变区的免疫功能，进一步完善了对于变链菌表面蛋白的结构和功能的认识。

目录

缩略词

摘要

引言

实验一 重组质粒pEGFP-N1-SrV+和空载体质粒pEGFP-N1提纯和鉴定

材料与方法

结果

分析与讨论

实验二 重组质粒pEGFP-N1-SrV+免疫SD大鼠后的原位表达

材料与方法

结果

分析与讨论

实验三 重组质粒pEGFP-N1-SrV+免疫SD大鼠后对龋齿的影响

材料与方法

结果

分析与讨论

小结

参考文献

附录

致谢

综述

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