Rib蛋白，一种可提供对多种B族链球菌菌株免疫的细胞表面蛋白，其纯化方法，试剂盒及药物组合物

摘要

本发明涉及一种被称为Rib的新蛋白质，及其亚碎片、多体蛋白和变型，它们可提供对由B族链球菌，特别是B族链球菌血清型III的菌株引起的感染的保护性免疫。本发明包括该蛋白质的纯化方法，其高度特异性抗体的制备方法，试剂盒、编码该蛋白质的DNA序列以及含有该蛋白或其片断或变型的药物组合物。

说明书

本发明涉及一种被称为Rib的新蛋白质(及其亚碎片、变型、多体蛋白)—它可提供对大部分侵入的B族链球菌菌株的免疫，该蛋白的纯化方法，该蛋白的特异性抗体，试剂盒及含有该蛋白或其片断的药物组合物。

在近三十年，B族链球菌已成为西方国家新生儿疾病的主要原因。仅在美国，每年约有10000病例是由这种细菌的侵入引起的。这种感染的总死亡率约为20％，许多幸存的婴儿终生患有神经性后遗症。基于这些发现，人们已做了大量工作来寻求预防和治疗的方法，并分析B族链球菌引起感染的机制。

约有20％的妇女阴道中携带B族链球菌，而且由这种细菌引起的新生儿疾病最普通的感染途径可能是从母亲的产道垂直传播。但在初生时带有B族链球菌的婴儿中仅有1～2％受到严重感染。因引，除了在出生时暴露于此细菌中之外，还有其它因素导致了新生儿疾病的发展。患儿母亲对III型荚膜的抗体水平明显低下，这意味着这些抗体对预防新生儿疾病是很重要的(Baker，C.J.和D.L.Kasper，N.Engl.J.Med.1976.294：753)。

根据多糖荚膜的不同结构B族链球菌菌株可分为四种主要的血清型(Ia，Ib，II和III)(Baker，J Inf Dis 1990.161：917)。在正常菌群的菌株中，血清型I、II和III的比例基本相同，但从侵入感染分离出的菌株中III型约占三分之二。由于已知荚膜是毒性因素，所以已对比(特别是III型菌株)进行了深入研究。已研制出一种疫苗，其中的必要成份是III型多糖荚膜。但多糖荚膜疫苗会与人体组织交叉反应引起一些问题(Pritchard等人，InfectImmun1992.60：1598)。因此如果能研制出一种基于蛋白而不是多糖的疫苗将很有价值。

B族链球菌还会引起母牛乳腺炎，这是一种有经济重要性的牛类疾病。因此，研制抗B族链球菌感染的疫苗在兽医学中也是有意义的。

先前已对两种B族链球菌细胞表面蛋白进行过细致研究：α和β蛋白。这些蛋白提供对表达该蛋白的菌株的预防，免疫，但是它们对B族链球菌疾病意义不大，因为这些蛋白通常不被引起大部分严重感染的III型菌株表达。

本发明涉及一种链球菌细胞表面蛋白及其变型和亚碎片。这种蛋白被称为Rib蛋白，是从血清型III的B族链球菌菌株中分离出来的95KD(千道尔顿)蛋白。Rib蛋白可被几乎所有血清型III的B族链球菌菌株和部分其它血清型如血清型II的菌株表达。设计了一种纯化Rib蛋白的方法，并表明这种蛋白的抗体可以预防由Rib蛋白表达菌株引起的致命性感染。

本发明还涉及可以预防由Rib蛋白表达菌株(即，特别是血清型III的B族链球菌)引起的感染，天然存在及人工修饰的该种蛋白的变型、亚碎片和多体蛋白。

本发明还涉及一种载体，如质粒、粘性质粒或噬菌体，其中含有Rib蛋白及其变型、亚碎片和片断的遗传密码，并适于插入非人生物体宿主中并在该宿主中表达。本发明中特别涉及三种噬菌体克隆：λRib1—3，λRib1—5和λRib1—7。其保藏号分别为DSM…。

本发明还涉及可编码Rib蛋白及其变型、亚碎片断片和多体蛋白的DNA序列，该序列可插入适宜载体中，如质粒、粘性质粒或噬菌体。该DNA序列可得自所保藏的噬菌体λRib1—3，λRib1—5，λRib1—7。

Rib蛋白可由不同的III型菌株表达。从几种不同的菌株制备提取物，用Western印迹法检测(用抗—Rib血清分析)，结果表明几乎所有的提取物中均含有Rib蛋白，但该蛋白的分子量在65和125kD之间变化(未列出数据)。此结果并不意外，因为先前对其它B族链球菌蛋白(α和β蛋白)的大小变化进行过描述。

现有数据表明该蛋白可由多个单位组成，每个单位相应的分子量约为9kD。所以本发明包括95kD蛋白的或具有相同性质之基本单位的亚碎片和多体蛋白。变型包括氨基酸的替代或插入，但不能改变对抗该蛋白表达菌株引起的感染的保护能力。

已对B族链球菌有较多了解并可从被感染人体的血液中分离出来。本发明人所用的BM110菌株得自Dr.S.Mattingly(Uni-versity of Texas，San Antonio，Texas)。此处所提及的菌株均可从University of Lund和Lund University Hospital的发明人处得到Doctor Gunnar Lindahal，Department of Medical Microbiology，Solvegatan23，S22362 Lund，Sweden)。

可从血清型III的B族链球菌菌株，优选菌株BS30或BM110中分离Rib蛋白。本发明涉及一种纯化Rib蛋白的方法。

可按下列步骤分离该蛋白：培养表达该蛋白的B族链球菌菌株，分离培养基和/或微生物，用一种酶消化该细菌，优选变溶菌素，可选择性加入蛋白酶抑制剂，从上清液中分离消化后的细菌并从上清液中提取Rib蛋白。所用培养基可为任何适于培养链球菌的培养基，如Todd-Hewitt培养液(Oxoid)，优选将细胞培养1—30，特别是12—20小时。用一种酶消化，优选变溶菌素，在不振荡条件下消化1—30，特别是10—20，优选15—18小时，温度为20—40℃，优选37℃。也可以从培养基中分离蛋白质，在这种情况下不必用酶消化来破碎细胞壁。加入一种蛋白酶抑制剂，如氯化苯甲脒、碘乙酸或苯基甲基磺酰氟，以防止污染变溶菌素或存在于微生物中的蛋白酶的作用。

该蛋白可用离子交换色谱法(优选阴离子交换色谱法)和凝胶过滤法纯化，并按照本技术领域内已建立的方法收集含有该蛋白的部分。

本发明特别涉及基本纯的Rib蛋白及其亚碎片。“基本纯”是指一种物质中不含药学上有害的成分。

本发明特别涉及基本纯的Rib蛋白及其亚碎片、变型或多体蛋白相应的抗体。已知用抗原免疫动物的方法，在这里是用Rib蛋白免疫，收集血液，分离血清，使用与该蛋反应的抗体。含有该抗体的血清或IgG部分可用于分析该蛋白。

由于Rib蛋白的抗体可以预防由B族链球菌引起的致命性感染，所以如有一种适于检测该抗体的方法会很有价值，例如用以估算妊娠妇女是否具有足够的抗体来预防婴儿的该种感染。因此可用Rib蛋白或其碎片来检测该蛋白的抗体。所以本发明还涉及一种含有Rib蛋白或其亚碎片的试剂盒。

另外，分析各种试样中是否存在Rib蛋白也是很有意义的。可用该蛋白的抗体达到此目的。因此本发明还涉及一种检测该蛋白的试剂盒，其中含有Rib蛋白或其亚碎片的抗体。该试剂盒可含有含该抗体的任何上述血液成分。其中还可含有该蛋白质及其亚碎片或多体蛋白，以用作标准品。

Rib蛋白的性质表明该蛋白可用以研制抗B族链球菌疫苗。因此本发明还涉及一种药物组合物，其中含有该蛋白或其片断作为活性组分，同时可含有药学上可接受的辅料和赋形剂。适用的药学上的辅料是本领域中常用的那些。适用的赋形剂的例子有甘露糖醇、乳糖、淀粉、纤维素、葡萄糖等，此处仅提及一部分。所列举的辅料和赋形剂不应被认为是对本发明的限制。

下面用附图详细介绍本发明，其中：

图1表明了用Western印迹法分析由代表四种主要血清型(Ia型：A909菌株；Ib型SB35；II型：B1284；III型：BS30)的B族链球菌株制备的提取物的结果。如免疫印迹所示，Ia型和Ib型表达α和β蛋白，用箭头表示这些蛋白在染色后的凝胶中的位置(下面的箭头：α抗原；上面的箭头：β抗原)。用星号表示III型BS30菌株的95—kD Rib蛋白在染色后的凝胶中的位置。分子量标准品示于左侧，单位为kD。

图2A和2B表明了从III型BS30菌株纯化Rib蛋白的方法。(A)将预先用DEAE离子交换色谱法部分纯化的变溶菌素提取液用DEAE Bio-Gel A的30ml离子交换色谱柱处理，用NaCl在10mM Tris中的溶液(800ml，PH8.0)进行线性梯度洗脱，再用1MNaCl(60ml)洗脱。阴影区表示含有Rib蛋白的部分。插图表示用SDS-PAGE法分析含有Rib蛋白部分的合并液的结果；分子量标准示于左侧，单位为kD，用箭头表示Rib蛋白(95kD)的位置。(B)将离子交换色谱中得到的含有Rib蛋白部分的合并液再用Sepharose CL6B凝胶过滤柱(4.2×90cm)处理。阴影区表示含有Rib蛋白的部分，插图表示用SDS-PAGE法分析这些部分的合并液的结果。V_o为空体积，Vt为总体积。

图3A、3B和3C表明了四种主要血清型的B族链球菌菌株对α、β和Rib蛋白的细胞表面表达。测定了五种菌株：A909(Ia型)；SB35(Ib型)；B1284(II型)；BS30(III型)和BM110(III型)。表示这五种菌株的符号示于框C中。如图所示，用不同浓度的α、β和Rib蛋白兔抗血清培养细菌悬浮液。X轴上的数字表示细菌混合液中抗体的最终稀释度。与放射性同位素标记的蛋白G孵育测定结合抗体。在所有实验中均包括预免疫兔血清的对照液，并均呈阴性反应。

图4表明了用纯化蛋白诱导的兔抗血清检测纯化α、β和Rib蛋白的Western印迹分析结果。所用抗血清的稀释度为1∶1000，用放射标记的蛋白G测定结合抗体。分子量标准示于左侧，单位为kD。

图5表明了纯化α、β和Rib蛋白经胰蛋白酶和胃蛋白酶处理后的SDS—PAGE分析结果。在PH7.5进行胰蛋白酶处理，在PH4.0进行胃蛋白酶处理。在SDS—PAGE分析之前先中和样品。对照组与含有胰蛋白酶或胃蛋白酶的样品同样处理，但不加入酶；这种处理不会消化蛋白。P＝胰胃蛋白酶；T＝胰蛋白酶。分子量标准示于左侧，单位为kD。

图6A、6B和6C表明了由BM110菌株克隆rib—基因以及用大肠杆菌表达Rib蛋白的结果。(A)用Westerr印迹法分析7种不同的λ克隆。用Rib抗体孵育。(B)限制性消化BM110菌株的染色体DNA。(C)限制性消化表达Rib的λ—克隆，λRib3。

用SDS—PAGE法和免疫印迹法分析了几种不同血清型菌株的变溶菌素提取物(用α和β蛋白的抗血清)，参见实施例1。图1表明了从代表4个主要血清型的4种菌株得到的结果。由Ia型和Ib型菌株表达的α和β蛋白在染色凝胶的高分子区域有特征条带。与以前的发现相同，两个菌株间这些蛋白的大小有所不同。III型菌株提取液中还有一种主要蛋白出现在高分子区域内，尽管该菌株并不表达α蛋白或β蛋白。在其他III型菌株的提取液中也发现有这种高分子量特征蛋白。不同菌株间该蛋白大小有变化。这些与α和β蛋白共同的特点吸引人们对III型菌株高分子量蛋白进行更细致的研究。选用了BS30菌株，因为已知它对鼠有毒性。从变溶菌素提取液中纯化(实施例2)该菌株表达的95kD蛋白(图1)。用两个连续的离子交换色谱步骤，再用凝胶过滤(图2)进行纯化。用SDS—PAGE法分析各部分中是否出现95kD蛋白。当合并并分析凝胶过滤后相应的部分时，仅发现两种蛋白：大量的95kD蛋白和少量的90kD蛋白(参见图2B中的插图)。90kD蛋白很可能是95kD蛋白的降解产物，因为之后发现这两种蛋白具有相同的氨基末端序列。这种纯化的蛋白被称为Rib蛋白(R—抗蛋白酶，i—免疫，B—族)。用SDS—PAGE凝胶的切片免疫家兔制备95kD型Rib蛋白的抗血清。

为了分析Rib蛋白是否是一种细胞表面蛋白，测定了代表4种主要血清型的菌株与抗Rib血清的结合能力。研究的五种菌株中包括上述四种菌株和另一种III型菌株，BM110，它是一种高毒性的III型菌株克隆。作为对照，还测定了这五种菌株对α和β蛋白的表达(用高度纯化的α和β蛋白制备物的抗血清)。

正如所预料的，抗α血清与Ia和Ib菌株反应剧烈，但它也与两种III型菌株有微弱反应(图3A)。但是，用Western印迹法分析表明III型菌株变溶菌素提取液中不含有可检测的α蛋白。因此抗α血清与整个III型细菌的微弱反应可能是与其它细胞壁成份的交叉反应。该结果表明可用与抗α血清的反应明确检测某菌株细胞表面是否表达α抗原。从抗β血清获得了类似的结果(图3B)。

Rib蛋白的抗血清与两种III型菌株反应，而不与Ia型和Ib型菌株反应(图3C)。与II型菌株显示出中等水平的结合。用West-ern印迹实验分析五种菌株的变溶菌素提取液(用抗—Rib血清进行测定)III型菌株反应强，在95kD有主要印迹条带，但其它三种菌株的提取液完全没有反应(未列出结果)。此结果表明抗—Rib血清与II型菌株的中等反应是交叉反应，在Western印迹条件下便消失了。可判定Rib蛋白是由两种III型菌株的细胞表面表达的，而不被另外三种菌株表达。

从侵入感染中分离了已知血清型的共58个菌株，测定它们与Rib蛋白抗体的结合能力(参见表1，实施例6)。还测定了每种菌株与α和β蛋白抗体的结合。为了简化对众多菌株的研究，每种抗血清仅在1000倍的稀释度进行测定，这是基于图3中所示结果选择的。此类分析得出明确结果，总结于实施例6的表1中。33种II型菌株中有31种、13种II型菌株中有1种细胞表面发现有Rib蛋白，但12种Ia和Ib型菌株中均未发现。

细胞表面缺乏Rib蛋白的菌株可能会向培养基中分泌该种蛋白。将列于表1中的58种菌株的培养基上清液用点印迹实验进行分析(用抗Rib血清测定)。在细胞表面不表达该蛋白的26种菌株的培养基上清液中均未发现Rib蛋白，但在细胞表面表达该蛋白的32种菌株中有26种的培养基上清液中发现了Rib蛋白(未列出结果)。

用鼠保护模型研究家兔Rib蛋白抗体是否能防止B族链球菌致命性感染(表2，实施例7)。如所示，对照组动物接受α蛋白抗血清或预免疫抗血清。结果表明Rib蛋白抗血清可以防止鼠对Rib蛋白表达菌株的致命性感染。

由于Rib蛋白象α和β蛋白一样可以提供保护性免疫，所以对这三种蛋白质的比较是很有意义的。进行了Western印迹实验(用纯化蛋白的抗血清进行分析)(图4)。染色凝胶表明三种蛋白是高度纯化的(在每个制品中有一种主要的蛋白)，但在三种蛋白之间没有血清学交叉反应，如Western印迹所示。

最开始区别α和β蛋白是由于其蛋白酶敏感性不同。α蛋白对胰蛋白酶稳定而对胃蛋白酶敏感，而β蛋白对这两种蛋白酶均敏感(Bevanger和Maeland，Acta Path Microbiol Scand Sect B1979.87：85)。用纯化的α和β蛋白进行实验证实了这一区别，并表明Rib蛋白对胰蛋白酶和胃蛋白酶都稳定(图5)。如所预料的，三种蛋白质均对蛋白酶K的消化敏感(未列出结果)。Rib蛋白对蛋白酶的稳定性不是由于出现了抑制剂，因为即使在Rib蛋白存在下β蛋白也可被胰蛋白酶和胃蛋白酶完全消化(未列出结果)。下列实施例将详细介绍本发明，但并不限制本发明的范围。

实施例1：蛋白质的鉴别。

这里用代表4种主要血清型的四种B族链球菌作为参照菌株：A909，Ia/c型；SB35，Ib型；B1284，II型；BS30，III型。BS30菌株是从Lund University Hospital某患新生儿感染的男孩体内分离的。所有菌株均在37℃的Todd-Hewitt培养基中(Oxoid)生长，不振荡。各菌株的变溶菌素提取液用SDS-PAGE法和免疫印迹法(用α和β蛋白的抗血清)进行分析。小规模制备链球菌菌株变溶菌素提取液的方法与大规模制备用于蛋白纯化的提取液的方法相同，但仅用50ml的培养液制备20％的细菌悬浮液，从中取1ml试样用酶消化。

按标准技术进行SDS-PAGE实验，聚丙烯酰胺的总浓度为10％，交联度为3.3％。样品在含有2％的SDS和5％2—疏基乙醇的溶液中煮沸3分钟后再进行电泳。分离后的蛋白用考马思亮蓝R—250染色或者经电印迹转移到甲醇活化的聚偏二氟乙烯基膜(Immobilon-P；Millipore Corp.，Molsheim，France)上(用Semi-Dry电印迹仪(Ancos，Vig，Denmark))。按标准步骤用明胶封闭Immobilon膜，再用稀释了1000倍的指定型家兔抗血清孵育(参见实施例7)然后用放射标记的蛋白G孵育，并进行放射自显影。

按氯胺-T法用无载体的放射性同位素I¹²⁵(Amersham Inter-national，England)标记蛋白。用MicroBCA蛋白检定试剂(Pierce)测定蛋白质的总浓度。用Bio-Rad422型电洗脱仪从SDS-PAGE凝胶中电洗脱蛋白。

结果示于图1。

实施例2.Rib蛋白的纯化

从10L培养过液的BS30菌株的培养物中沉降细菌，并用50mM Tris缓冲液(PH7.3)洗涤2次，再用同种缓冲液悬浮成20％(V/V)的悬液。将变溶菌素(Sigma Chemical CO.，ST.Louis，MO)在10mM)磷酸钾溶液(PH6.2)中溶解成5000单位/ml，然后加到细菌悬液(125ml)中至最终浓度为350单位/ml。轻微振荡使消化在37℃持续17小时，再加入蛋白酶抑制剂至下列浓度：氯化苯甲脒，5mM；碘乙酸，5mM；苯基甲基磺酰氟，2mM。将悬浮液离心并立即将上清液对10mMTris(PH8.0)缓冲液渗析(渗析管为Spectrapor No.4)。如初始实验所示，将渗析后的产物连续两次进行离子交换层析，以最佳回收纯Rib蛋白。用SDS-PAGE检测Rib蛋白的存在并目测凝胶中出现的95kD条带。在第一步层析中，将渗析液(110mM)与等体积0.4M NaCl在10mM Tris中的溶液(PH8.0)及30ml DEAE Bio-Gel A(BioRad Laboratories，Richmond，CA)混合，用10mMTris(pH8.0)平衡。将该混合液缓缓搅动1小时(4℃)，用玻璃滤器过滤，将未吸附的物质(含Rib蛋白)与凝胶分离。在第二步层析中(图2A)，将含有Rib蛋白的滤液用蒸镏水稀释20倍，以降低离子强度，并与30ml DEAE Bio-Gel A混合，如上所述进行平衡。缓缓搅动16小时(4℃)，过滤，回收凝胶，用10mM Tris(PH8.0)洗涤。将吸附的蛋白(包括Rib蛋白)用800ml盐溶液线性梯度洗脱(0-0.2M NaCl于10mM Tris中，PH8.0)，再用1M NaCl(60ml)洗脱。收集各部分，合并含有Rib蛋白的部分，浓缩，再进行凝胶过滤，用Sepharose CL6B(4.2cm×90)柱，洗脱液为PBSA(0.12MNacl，0.03M磷酸盐，0.02％N_aN₃，PH7.2)(图2B)。用SDS-PAEG电泳分析各部分中是否出现95kD条带。合并含有Rib蛋白的部分并冷冻。25g细菌中约得到Rib蛋白6mg。为了保证用于免疫化学分析的Rib蛋白制品的纯度，将该蛋白进一步用SDS-PAGE纯化，然后用电洗脱洗脱95kD条带。但SDS-PAGE分析并未显示这种电洗脱得到的物质与凝胶过滤步骤中回收的物质间的纯度差别。

前面已提及，Rib蛋白还存在于表达该蛋白的菌株的培养基中。可用类似于上述技术的方法从这样的培养基中纯化该蛋白。

将转移到Immobililon上的蛋白条带直接在膜上进行自动氨基酸序列分析(用Applied Biosystem 470A气—液固相序列仪)。用考马思亮蓝将膜淡淡地染色以确定蛋白条带的位置，然后将该蛋白条带切下来用于序列分析。用Swissport Data Bank分析蛋白质序列。

得自BS30菌株的Rib蛋白的氨基末端序列示于SEQ ID No.1纯化的Rib蛋白中含有分子量约为95kD和90kD的两种蛋白质(图2B)，它们含有相同的氨基末端序列，这表明小分子是大分子的降解产物。研究结果表明Rib蛋白的氨基末端序列是独特的。

还用同样的纯化步骤从BM110菌株中分离了Rib蛋白。从BM110菌株分离的Rib蛋白的氨基末端序列(SEQ ID No2)与从BS30菌株分离的Rib蛋白的氨基末端序列在第7位有所不同，BM110的蛋白中为Ser，而不是ASP。

实施例3α蛋白的纯化。

从SB35菌株中纯化α蛋白，它是表达α和β蛋白的Ib型菌株。使用类似于从BS30菌株中纯化Rib蛋白的方法。用点印迹法分析各组分中α蛋白的存在，使用了家兔抗—α血清(由挪威Trondheim大学Dr.L.Bevanger提供)和¹²⁵I放射性同位素标记的蛋白G(Calbiochem Co.，San Diego CA)进行分析。在离子交换和凝胶过滤步骤中，α蛋白的现象类似于Rib蛋白(cf.图2)。凝胶过滤步骤中回收的α蛋白呈现一尖峰。用不同的抗血清分析该物质表明，其中含有痕量的β蛋白，β蛋白是将制品通过一个IgA-Sepharose小柱子除去的。根据SDS-PAGE分析，纯化的α蛋白分子量约为110,000(cf.图4)。从39g细菌中得到了12mgα蛋白。如前面对Rib蛋白所述，将用于免疫化学研究的α蛋白从SDS-PAGE凝胶上电洗脱进一步纯化。但SDS-PAGE分析未表明这种电洗脱得到的物质与从凝胶过滤中回收的物质间的纯度差别

实施例4.β蛋白的纯化。

用类似于纯化Rib和α蛋白的方法纯化与IgA结合的β蛋白(Russell-Jones等人，J.Exp，Med.1984，160：1467)。将洗涤过的细菌SB35在50mM甘氨酸-NaOH缓冲液中(PH11.0)孵育(悬液的最终PH为9.7)得到初始材料。本实验室以前的研究表明在这样的提取液中主要的蛋白种类是β蛋白。将提取液(220ml)立即对10mM Tris(PH8.0)渗析，用蒸馏水稀释20倍，并与40ml DEAE Bio-Gel A混合(用10mM Tris平衡，pH8.0)。在4℃缓缓搅拌2小时，将凝胶转移到柱中用800ml盐水线性梯度洗脱(0-0.2M NaCl在10mM Tris中的溶液，pH8.0)，用点印迹法分析各部分(10ml)中是否存在β蛋白，用放射标记的IGA或抗-β血清和放射标记的蛋白G进行分析。β蛋白在梯度的第一区段被洗脱下来。合并相应的部分，浓缩，用AcA34(Pharmacia-LKB，Uppsala，Sweden)柱(4.2×100cm)在PBSA中进行凝胶过滤，洗脱β蛋白，其峰形很好。合并相应的部分、浓缩、冷却。23g细菌中得到了9mg纯化蛋白。根据SDS-PAGE分析，在该制品中主要蛋白的分子量为130,000，但用Western印迹法分析该蛋白时还发现有少量低分子量的降解产物。

实施例5对蛋白酶敏感性的分析。

取200微升纯化的α、β或Rib蛋白(0.5mg/ml)，与胰蛋白酶、胃蛋白酶或蛋白酶K(0.2mg/ml)在37℃孵育1小时，分析对蛋白酶的敏感性(图5)。胰蛋白酶的消化是在0.25M磷酸钠(pH7.5)中进行，胃蛋白酶的消化在0.25M醋酸钠(pH4.0)中进行，蛋白酶K的消化在0.25M Tris(pH7.4)中进行。在用SDS-PAGE分析之前中和样品。

实施例6对链球菌菌株α、β和Rib蛋白细胞表面表达的分析。

首先分析了可从本实验室得到的五种菌株的α、β和Rib蛋白细胞表面表达。然后从侵入感染的病例中分离并获得了58个B族链球菌菌株，用于分析对这些细胞表面蛋白的表达(见表1)。用标准技术在Lund University Hospital的临床微生物实验室将B族链球菌分型。

取10ml过夜培养的培养物，将细菌用PBSAT(PBSA中添加0.05％吐温20)洗涤2次，并制备1％PBSAT细菌悬液。将该细菌悬液的试样(180μg)与20μl稀释于PBSAT的兔抗血清混合，将混合液在23℃孵育1小时。再加入2mg PBSAT，离心沉降细菌，用2mlPBSAT，洗涤1次，再悬浮于200μlPBSAT中。然后加入25μl放射标记的蛋白G(在PBSAT中，约104pm)，在23℃再保温1小时，以测定结合的IgG。再加入2mlPBSAT，离心沉降细菌并加入2ml PBSAT洗涤沉淀物。最后一次离心后弃去上清液，测定沉淀的放射性。测定多种菌株对α、β和Rib蛋白的表达时(表1)，仅使用最后的稀释度为1∶1000的抗血清。在所有实验中均包括预免疫兔抗血清对照组并均呈阴性反应。33种III型菌株中有31种菌株中发现细胞表面有Rib蛋白，但12种Ia和Ib型菌株中均未发现该蛋白。

表1.从侵入感染的患者体内分离的58种B族链球菌对α、β和Rib蛋白的细胞表面表达。

                       荚膜型  所表达的     Ia        Ib      II       III  蛋白       (n＝9)    (n＝3)  (n＝13)  (n＝33)  α                       6         0       4        0  β                       1         0       0        0  α和β               1         3       5        0  Rib          0         0       1        3  无           1         0       3        2

用特异性抗血清分析α、β和Rib蛋白的细胞表面表达，用放射标记的蛋白G测定结合抗体，结果示于图3。

此处研究的58种菌株均是从侵入感染的病例中分离出来的，但并不代表随机收集菌株，因为最初收集的菌株中仅有2种是II型菌株，大多数II型菌株是后来补充的。

实施例7抗血清的制备和鼠保护实验

所有抗血清均由家兔产生，在背部皮下免疫，将SDS-PAGE凝胶中相应的95kD条带切下，分成小片并与弗氏完全佐剂混合，用以制备菌株BS30表达的Rib蛋白的抗血清。初次免疫时将6片(约60μg蛋白)溶于1mlPBS中并与1ml佐剂混合。用3个条带(30μg蛋白)进行加强剂量注射。4周后给第一次加强剂量，再给3次加强剂量，间隔为2周。然后从家兔抽血3次，间隔为3周，将从3个血样中得到的血清合并，用于本实验。用同样方法制备α蛋白的抗血清。在纯化中用于各部分分析的抗α血清的第一个试样得自Dr Lars Bevanger，Trondheim。纯化β蛋白的抗血清可从本实验室得到。

所用的C3H/HeN鼠由本部门饲养，年龄为10—20周。给鼠腹腔注射0.5ml用PBS稀释了5倍的兔血清，4小时后腹腔注射0.5ml用Todd-Hewitt培养基稀释的对数期的细菌来感染。所用的细菌的数量约为90％致死剂量(LD₉₀)。对于BM110，BE210和SB35 sed l为2×10⁶c.f.u.，对于BS30和L25为2×10⁷c.f.u。每天记录死亡动物的数量，记录4天。对照组动物通常在24小时内死亡。

表2Rib蛋白的兔抗血清防止表达该蛋白的B族链球菌对鼠的致命性感染。菌株    荚膜型    相关的细    用下列血清预处理后小鼠内存活数＋

              胞表面蛋

                白

                              抗-Rib     抗-α血清  正常血清

                                血清BS30        III    Rib              29/32′   1/15        4/20BM110       III    Rib              15/24′   0/15        0/15L25         III     -                0/15     2/14        n.d.11BE210        II    Rib              10/15′   0/14        n.d.SB35sedl     Ib   alpha              1/15    10/15^-      n.d.给C3H/HeN鼠由腹腔注射0.1ml兔抗血清(用PBS稀释至0.5ml)，4小时后用LD₉₀剂量的对数期细菌(用Todd-Hewitt培养基稀释至0.5ml)攻击。用X²检验分析存活数据。

^-Rib蛋白或α蛋白的表达(与这些实验相关的两种抗原)。+存活了4天的鼠的数量/被感染的鼠的总数。P＜0.001，与接受抗α血清或正常血清的对照组相比。

n.d＝未检测。

¹P＜0.001，与接受抗α血清的对照组相比。

^-P＜0.01，与接受抗Rib血清的对照组相比。

表2中的数据表明Rib蛋白的抗血清防止了BS30的致命性感染，BS30是从中纯化了Rib蛋白的III型菌株。如对照组血清的实验所示，这种保护不是非特异性的。抗-Rib血清还可防止另一种III型菌株的致命性感染，BM110，一种高毒力B族链球菌菌株克隆(Musser等，Proc.Natl.Acad.Sci USA1989.86：4731).相反。抗-Rib血清不能防止L25菌株(一种不表达Rib蛋白的III型菌株)的感染。(表1)。如表达Rib蛋白的II型菌株的实验所示，抗-Rib血清的保护作用并不仅限于III型菌株。如同所预料的，抗-Rib血清不能防止表达α抗原的Ib型菌株。总之，这些数据有力地说明了在几乎所有III型菌株中和部分II型菌株中，即，在大部分引起侵入感染的B族链球菌中，Rib蛋白是一种毒性因素。

实施例8 rib-基因的克隆以及Rib蛋白在大肠杆菌中的表达

从菌株BM110(一种高毒性的血清型III菌株克隆)中克隆Rib蛋白的结构基因。由该菌株表达的Rib蛋白(SEQ ID No.2)和由菌株BS30表达的Rib蛋白(SEQ ID No.1)具有类似的大小和氨基未端序列。在噬菌体α中构建BM110菌株的DNA文库。将500ml Todd-Hewitt培养液中对数期BM110菌株的细菌离心沉降。将沉淀物冷冻、再融化，反复3次，悬浮于20ml TE缓冲液中(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)，离心，洗涤，再悬浮于4ml同种缓冲液中。将变溶菌素(Sigma Chemical Co.St Louis，Mo，USA)在10mM磷酸钾(pH6.2)中溶解成5000单位/ml，加入细菌悬液中使最终浓度为500单位/ml。加入溶菌酶(Sigma)至最终浓度为8mg/ml，在37℃消化3小时。加入200μl 10％SDS和500μl吐温溶菌混合液(2％吐温—20，50mM Tris pH8.0，60mMEDTA)使细菌细胞溶解，然后再加入200ml10％SDS。将溶菌产物用蛋白酶K(Sigma，100μg/ml于50℃处理19小时，然后用苯酚和氯仿反复提取。用乙醇沉淀DNA，用高速真空浓缩仪(SAVAC)干燥，溶于4.5ml TE缓冲液中。然后将DNA用CsCl密度梯度超速离心进一步纯化，再对TE缓冲液透析。DNA浓度约为2.5μg/ml。将DNA用Sau 3AI(Promega)部分消化，并连接于Bam HI切割的λEMBL 3(Statagene)的臂上。将重组噬菌体DNA用Gigapack II Gold Packaing Extract(Stagagne)体外包装。将DNA文库覆在大肠杆菌菌株LE392上，用免疫印迹技术筛选产生Rib蛋白的菌株：用硝酸纤维素薄膜覆盖约有1000个溶菌斑的板，于4℃放置1小时。将膜移开、封闭、用含有兔抗Rib血清的缓冲液孵育，稀释50倍。加入过氧化物酶标记的蛋白A(Sigma)(20μg/ml)检测阳性溶菌斑(即与兔IgG结合的溶菌斑)，并用标准技术显现过氧化物酶的存在。分离出7种独立表达Rib的λ克隆，其中三种克隆，即λRib-3、λRib1—5和λRib1—7保藏于Deutsche Sammlung Von Microorganismen，保藏号分别为DSM……。另外还制备了λRib1—3克隆的DNA，DNA浓度约为0.5μg/μl。将7种克隆的溶菌产物用抗—Rib血清进行Western印迹分析(参见图6)。有些克隆所表达的Rib蛋白与从BM110菌株中直接分离的Rib蛋白大小相等。

(1)一般信息：

(i)申请人

(A)姓名：Gunnar Lindahl

(B)地址：Magnus Stenbocksgatan 5

(C)城市：Lund

(E)国别：瑞典

(F)邮编(ZIP)：22224

(ii)发明名称：Rib蛋白，一种可提供对多种B族链球菌菌株免疫的细胞表面蛋白；其纯化方法，试剂盒及药物组合物。

(iii)序列数目：2

(iv)计算机可读形式

(A)介质型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作系统：PC—DOS/MS—DOS

(D)软件：Patentln Release#1.0，Version#1.25(EPO)

(V)目前申请资料：

申请号：

(2)SEQ ID No.1的信息

(i)序列特征

(A)长度：12个氨基酸

(B)形式：氨基酸

(D)拓扑结构：线形

(ii)分子类型：蛋白质

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(v)片断形式：氨基未端

(vi)来源：

(A)生物体：B族链球菌

(B)菌株：BS30

(xi)对序列的描述：SEQ ID NO.1：

    Ala Glu Val Ile Ser Gly Asp Ala Val Thr Leu Asn

    1               5                   10

(3)SEQ ID No.2的信息

(i)序列特征

(A)长度：12个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线形

(ii)分子类型：蛋白质

(iii)假设：无

(v)片断形式：氨基末端

(vi)来源：

(A)生物体：B族链球菌

(B)菌株：BM110

(xi)对序列的描述：AEQ ID No：2：

      Ala Glu Val Ile Ser Gly SerAla Val Thr Leu Asn

     1                5                  10