宏基因组学技术在病原体检测中的应用

摘要

环境微生物是地球上种类最多、数量最大、分布最广的生物类型，据估计，地球上存在超过1030个微生物。微生物的传统研究方法主要是基于微生物纯培养和分离，到目前为止，绝大多数微生物（99％以上）无法依靠上述方法获得，这极大地限制了对微生物的研究。借助于高通量测序技术快速发展起来的宏基因组学，在病原体检测中发挥着越来越重要的作用。　　宏基因组测序无需筛选得到各微生物群落的纯培养物，而是直接测定样品中所有微生物的核酸序列，这样可避免实验污染带来的偏差。宏基因组学的研究主要有16S rDNA测序和全基因组测序两种。16S rDNA测序以环境样品中的16S rDNA为研究对象，全基因组测序(whole genome sequencing)只需直接提取出微生物基因组进行测序。　　本研究基于宏基因组测序，探索未知病因样本中可能存在的致病微生物，为揭示疾病的发生和发展提供线索。　　我们提取10份烂脚病样品细菌核酸，扩增16S rDNA的V1~V2高变区，测序后分析其中的菌群构成，在所有样本中均有检出与伤口溃烂有关的金黄色葡萄球菌和链球菌。　　16S rDNA测序有较多环节需要改进，如细菌核酸的提取、高变区的选择、通用引物的选择、测序平台的选择以及后期数据分析策略的选择。我们试验了七种方法对模拟样本进行细菌核酸提取，测序后，分析模拟样本中各种细菌的含量和相对分布，寻找一种广谱、高效的细菌核酸提取方法。　　在筛查一份未知病因发热病人的样品时，我们测序了其中病毒的宏基因组，发现了一株属于Microviridae的病毒基因组IME-16，与以往报道差异比较大，我们对其进行了注释、进化分析以及结构蛋白的分析，推测IME-16可能是与alphaviruses距离较远的一支。　　在测序一份乙肝病人血清样品的病毒宏基因组时，我们优化了生物信息分析方法，加快了数据分析的速度，同时也发现了一些以往报道与肝炎有关的Anelloviridae病毒序列，其中共发现10株Torque Teno Midi Virus(TTMDV)序列和3株Torque Teno Virus(TTV)序列与以往报道的序列差异大，我们对这些序列进行注释和进化分析，证实它们属于新型的Anelloviridae病毒。　　综上所述，我们采用宏基因组测序，筛查了一批未知病因烂脚病样品、一份未知病因发热血清样品以及一份乙型肝炎病人血清样品，发现了与疾病有关的致病菌以及新型病毒全基因组序列，同时，我们改进细菌基因组提取方法和数据分析方法。总之，随着宏基因组测序方法改进和分析技术提高，宏基因组学必将在病原体检测方面作出重大贡献。

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前言

第一部分细菌宏基因组学在病原体检测中的应用

第一章．未知病因足部溃烂样品致病因素的研究

1.引言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

第二章．16S rDNA宏基因组测序中细菌核酸提取方法的比较研究

1.引言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

第二部分病毒宏基因组学在病原体检测中的应用

第一章.一株新型Microviridae IME-16的发现及基因组分析

1.引言

2.材料与方法

3.结果和讨论

4.结论

第二章.新型Anelloviridae病毒在高通量检测乙型肝炎病人血浆中的发现

1.引言

2.材料与方法

3.实验结果

4.讨论

参考文献

附录

个人简历

致谢

综述:宏基因组学在检测和鉴定未知病毒应用的前景