基于RRBS技术的卵巢癌细胞系T29H的甲基化谱研究

摘要

背景:破坏RAS，RB和p53信号通路并且激活人端粒逆转录酶hTERT是在卵巢癌中经常发生的现象，然而他们具体的致病机理还不清楚。我们研究的卵巢癌T29和T29H细胞系，用SV40 large T抗原基因的转染破坏了p53和RB通路并激活了hTERT从而使正常卵巢上皮细胞形成了永生化但是没有完全转化癌变的T29细胞系，并通过进一步的导入了H-rasV12——一个在V12位点发生突变的H-ras突变基因，在永生系T29基础上形成了完全转化癌变的T29H细胞系。
　　 目的:在此研究中，我们使用性价比最合适的Reduced RepresentationBisulfite Sequencing(RRBS)方法对永生的T29细胞细胞系和恶变的T29H细胞系进行甲基化谱测序，配合数字基因表达谱(Digital Gene Expression，DGE)等其他实验方法试图展示卵巢细胞系T29-T29H恶变前后的表观遗传学上的变化，并为揭示卵巢恶变的形成提供一些线索。
　　 方法:本研究以细胞系T29和T29H的甲基化谱RRBS测序数据为主要分析材料，首先对测序原始数据进行过滤处理，然后将过滤后得到的高质量clean reads通过SOAP2比对软件比对到参考基因组和参考基因上，比对的结果用于后续的分析:采用TPM(Transcript Per Million clean tags)法计算基因表达量;采用Cytoscape的插件ClueGO中基于Kappa统计的聚类算法的KEGG pathway分析对差异甲基化区间(Differentially Methylated Region，DMR)在基因启动子区的基因及其表达数据进行KEGG pathway富集性聚类综合分析。
　　 结果:我们发现在这一转染变化导致恶变后，在T29细胞系转化为T29H细胞系的过程中，两个细胞系的甲基化谱也发生了显著且全面的变化。配合两个细胞系的基因表达数据，通过采用基于Kappa统计的pathway聚类分析等手段，我们筛选到了Inositol phosphate metabolism、O-Glycan biosynthesis和N-Glycanbiosynthesis等与能量代谢相关的pathway变化显著且符合瓦博格效应，并找到了启动子甲基化水平增加最明显同时表达降低最明显的基因RRAD。
　　 结论:在卵巢癌细胞系恶变的过程中糖代谢等相关通路的DNA甲基化与表达变化影响了恶变的发生。RRAD基因很可能作为一个关键靶标，对肿瘤的恶变发展产生重要影响。癌症的发生发展与全基因组的甲基化状态改变变化有显著的关联性。

目录

摘要

前言

材料与方法

2．1 实验材料

2．2 DNA提取和RRBS测序建库

2．3 原始数据处理与信息分析流程

2．4 基因甲基化与表达的注释与功能分析(二级分析)

结果

分析与讨论

小结

参考文献

附录

致谢

综述 基于下一代测序技术的甲基化谱在癌症研究中的应用

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