云南省主要推广核桃品种的分子标记鉴别及遗传分析

摘要

漾濞核桃(JuglanssigillataDode)为云南省重要的经济林树种之一，随着云南省核桃产业的发展，对于核桃遗传背景方面知识的需求和应用科学手段鉴别核桃品种，维持核桃市场秩序的需求日益增加。本研究利用RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNAs，即随机扩增多态性DNA)分子标记和ISSR(Inter-simpleSequenceRepeats简单序列重复间区)分子标记技术对云南省11个漾濞核桃品种进行分子鉴别和遗传分析。为品种鉴别提供分子水平上的参考，为核桃的育种提供理论依据。参试的11个核桃品种包括4个云南乡土核桃品种：漾濞泡核桃、大姚三台核桃、夹绵核桃和铁核桃和7个优良杂交品种：云新高原核桃(云新7914号)、云新云林核桃(包括：云新7926号、云新8034号、云新8064号)、云新90301号、云新90303号和云新90306号。研究的内容及结果如下： 1.DNA提取：以漾濞泡核桃不同生长时期的叶片为材料，采取了高盐低PH法和CTAB沉淀法提取基因组DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计和RAPD扩增3种方法对所提取的DNA样品进行检测。比较所得DNA的产量、质量，认为不同发育时期叶片得DNA提取效果不同，其中以冬芽和新叶效果较好，老叶最差；两种提取方法得到得的DNA产量和质量有所不同，高盐低PH法提取的DNA纯度高，但是产量较低，而CTAB法则相反，产量高，纯度低。 2.建立稳定的反应体系以漾濞核桃中的大姚三台核桃为实验材料，通过对影响RAPD扩增结果的主要因子：Tag酶、Mg+2、引物、模板DNA、dNTPs等不同的浓度组合和扩增程序的试验研究，确定了漾濞核桃的最适RAPD反应体系和扩增程序。即在25uL反应体系中包括0.75u.L-1TaqDNA聚合酶，3.0mmol.L-Mg+2，0.3mmol.L-1引物，含1.6mg.L-1模板，2.5ul10×Buffer，dNTPs各0.2mmol.L-1。扩增程序为：94℃预变性300s，94℃变性40s，36℃退火60s，72℃链延伸120s，45次循环后，72℃延伸600s。 ISSR反应体系和扩增程序为总的20uL反应体系中包含：模板DNA1.OuL(50ng)，10×Buffer2.OuL，10pmol.uL-1引物1.5uL，2.5mMdNTPs1.6uL，25mMMg+21.8uL，5UTaqDNA聚合酶0.12uL，ddH2011.98uL；热循环体系为：95℃预变性600s，然后94℃变性30s，50℃退火60s，72℃链延伸120s，共35个循环最后72℃延伸420s。 3.引物筛选通过对RAPD和ISSR引物的筛选，分别筛选出8个能够扩增出清晰、稳定并能扩增出多态性位点的RAPD引物和ISSR引物。RAPD引物为：SBSA07、SBSA08、SBSB06、SBSE11、SBSF10、SBSS03、SBSS06和SBSS10；ISSR引物及其退火温度为：ISSR01、ISSR04、ISSR14(退火温度50℃)，ISSR08、ISSR09、ISSR12、ISSR25(退火温度52.8℃)和ISSR23(退火温度48.6℃)。 4.指纹图谱建立，品种分子鉴别：RAPD引物SBSS06号引物所扩增的位点能够完全鉴别出11个漾濞核桃品种；ISSR标记的ISSR08和ISSR09这两条引物结合能够鉴别出参试的11个漾濞核桃品种，由此建立了各品种的指纹图谱。 5.遗传多样性：RAPD检测得到多态位点(PPB)值为61.63％，平均每条引物获得6.625个多态性位点；ISSR检测，PPB为63.27％，平均每个引物7.75个多态性位点，说明11个核桃品种间有一定的遗传差异。POPGENE32软件分析获得的遗传多样性参数分另为，RAPD检测的等位基因数(Ne)为1.3552，基因的多样性(H)为0.2110，Shannon信息指数(I)为0.3188；ISSR检测的Ne为1.3707，H为0.2143和I为0.3216，以上数据表明这11个品种间的遗传多样性水平不高。 6.品种间近缘关系：用RAPD和ISSR检测所得的Nei's遗传距离对参试的11个品种进行聚类分析分别绘制聚类图。RAPD检测的结果可以将11个品种分为三组：乡土优良品种(漾泡和三台核桃)，杂交优良品种(14、26、34、64、301、303和306)和品质较差的乡土品种(夹绵核桃和铁核桃)。ISSR检测的结果将11个品种分为4组：两个云南优良乡土品种、两个品质较差的乡土品种、亲本组合为漾濞泡核桃×云林A7号的4种(云新云林14、26、34、64)和亲本组合为三台核桃×新早13号的3种(云新云林301、303和306)。 7.RAPD和ISSR比较：比较RAPD和ISSR两种标记技术发现ISSR在可重复性和获得多态性位点的能力上强于RAPD标记技术。用Mantel检测对两种标记技术进行相关性分析(r=0.54392)认为本研究中RAPD和ISSR标记的相关性不显著。鉴于试验的稳定性、可重复性和单引物获得遗传多态位点的能力，认为ISSR标记技术更适合用于漾濞核桃的品种鉴别和遗传分析。

目录

文摘

英文文摘

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1前言

2实验材料和实验方法

3结果和分析

4.结论和讨论

5.展望

参考文献

致谢

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