TGF-β1诱导EMT与Ca2+促细胞成骨软骨分化作用在特发性高钙尿症泌尿系结石形成机制中的研究

摘要

第一部分、GHS大鼠/IH结石患者原代肾小管上皮细胞的分离、鉴定及特征分析
　　目的：分离、培养以及鉴定模型鼠遗传性高钙尿（GHS）大鼠以及特发性高钙尿症（IH）合并结石患者的原代肾小管上皮细胞PRECs(GHS)及PRECs(IH)，并研究两类细胞骨相关因子以及钙结合蛋白表达特征。
　　方法：分别在无菌条件下分离提取并培养大鼠肾小管上皮细胞PRECs(GHS)和IH患肾原代细胞PRECs(IH)。通过形态学观察以及角蛋白18（Cytokeratin18，CK18）免疫荧光化学法对所提取细胞进行鉴定。此外，通过CCK-8法对两类细胞不同代次（P1，P2，P3）之间活力进行检测。最后采用Real time PCR和Western blot技术分别对PRECs(GHS)和PRECs(IH)与相应对照细胞NRK和HK-2中钙结合蛋白Calbindin-D28k，骨相关因子BMP2和Runx2在mRNA和蛋白水平进行检测。
　　结果：GHS大鼠以及IH患肾原代肾小管上皮细胞PRECs(GHS)和IH合并结石患肾原代细胞PRECs(IH)均成功分离。细胞经CK-18的免疫荧光染色后，PRECs胞浆呈现较强特异性荧光。PRECs(GHS)和PRECs(IH)在细胞培养P1，P2和P3后，活力总体逐渐表现下降趋势，且在部分时间点差异具有统计学意义。PRECs(GHS)细胞中Calbindin-D28k，BMP2以及Runx2在mRNA和蛋白水平，其表达显著高于NRK细胞，同样其mRNA和蛋白在PRECs(IH)细胞中表达，相较对照细胞HK-2细胞亦显著上升。
　　结论：本实验成功分离鉴定GHS大鼠和IH合并结石患肾原代肾小管上皮细胞，且PRECs细胞可能存在骨性分化过程。
　　第二部分、TGF-β1相关Wnt11信号通路与L型钙离子通道参与特发性高钙尿症泌尿系结石形成的机制初探
　　目的：利用模型鼠GHS大鼠及其原代肾小管上皮细胞PRECs，研究泌尿系结石形成过程中潜在上皮间充质转分化（EMT）及成骨软骨分化机制。
　　方法：利用本实验组所培育GHS模型大鼠，应用酶联免疫吸附试验（Elisa）检测和比较 GHS大鼠和对照组 SD大鼠肾动脉、肾静脉及24小时尿样品中TGF-β1含量；提取 GHS大鼠原代肾小管上皮细胞PRECs，应用流式细胞术检测PRECs与NRK细胞内Ca2+浓度差异，并分别通过Real time PCR和Western blot检测PRECs和对照细胞系NRK在上皮表型（E-cadherin，CK19），间充质表型（Snail1，Zeb1）及成骨软骨表型（Col2A1,OPN,Sox9,Runx2）在mRNA和蛋白表达差异。另外，应用Real time PCR，Western blot和免疫荧光双重染色，通过慢病毒介导沉默TGF-β1下游重要信号分子Wnt11以及L-型钙离子通道阻断剂阻断Ca2+通道，观察分析其对PRECs细胞潜在EMT以及成骨软骨分化过程的影响。另外，通过外源性TGF-β1/Ca2+对NRK单独或联合作用，观察其对细胞EMT各表型以及成骨表型的影响。
　　结果：GHS大鼠TGF-β1表达在肾动脉、肾静脉及24小时尿中均高于对照组SD大鼠，而PRECs细胞中Ca2+浓度也高于对照NRK细胞系。PRECs细胞与NRK细胞相比，其Zeb1，Snail1，Col2A1，OPN，Sox9和Runx2在mRNA和蛋白表达水平均较高，而上皮表型E-cadherin，CK19表达均下调，表明PRECs细胞存在潜在EMT分化以成骨软骨分化。分别阻断PRECs细胞Wnt11信号以及L-Ca2+通道后，PRECs细胞EMT以及分化过程均被逆转，E-cadherin表达上调，而Snail1，Col2A1，OPN，Sox9和Runx2表达均减弱。外源性TGF-β1/Ca2+对NRK单独或联合作用发现，TGF-β1可显著增加NRK间充质表型，而Ca2+单独作用并不显著，联合作用可以显著促进细胞EMT进程以及成骨软骨分化。
　　结论：TGF-β1相关的Wnt11通路和L-Ca2+通道参与特发性高钙尿症结石形成过程，泌尿系结石形成过程可能存在肾小管上皮细胞EMT以及成骨软骨分化。
　　第三部分、Ca2+促进IH患者肾小管原代细胞PRECs通过TGF-β1诱导EMT途径向骨相关表型分化
　　目的：研究转化生长因子β1(TGF-β1)和钙离子在特发性高钙尿症肾结石发病中的作用机制以及相互间关系。
　　方法：运用酶联免疫吸附试验（Elisa）对所收集29例特发性高钙尿症合并结石患者（IH组），29例结石不伴特发性高钙症患者（nIH组）和对照组（NC组）外周血血清TGF-β1，骨桥蛋白（OPN）和骨形态发生蛋白2（BMP2）进行检测。然后通过RT-PCR和Western blot分别检测IH原代细胞PRECs与对照细胞HK-2中BMP2，OPN和维生素D受体（VDR）mRNA和蛋白表达。另外应用不同浓度TGF-β1(0.5ng/ml,2.0ng/ml，5.0ng/ml)和Ca2+（0.5mM，1.5mM，2.5mM）及最适TGF-β1/Ca2+浓度联合刺激HK-2和PRECs，通过RT-PCR，Western blot和免疫荧光染色观察单独以及联合刺激对各细胞BMP2，OPN和VDR表达影响。
　　结果：IH组内TGF-β1，OPN和BMP2表达明显高于nIH和NC组，而IH所提取原代肾小管上皮细胞PRECs中VDR和BMP2 mRNA和蛋白表达明显高于对照组HK-2细胞，TGF-β1/Ca2+单因素刺激PRECs和HK-2时，发现PRECs细胞中BMP2，OPN和VDR在mRNA表达上呈现剂量依赖性改变，而HK-2变化并不明显。TGF-β1/Ca2+共刺激PRECs和HK-2细胞，两类细胞BMP2，OPN和VDR表达均逐渐增加，且呈现时间依赖性变化。
　　结论：Ca2+可以促进PRECs通过TGF-β1诱导EMT途径向骨相关表型分化，此过程可能与特发性高钙尿症结石发病机制相关。

目录

声明

英文缩略词表

前言

参考文献

第一部分 GHS大鼠/IH结石患者原代肾小管上皮细胞的分离、鉴定及特征分析

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 TGF-β1相关Wnt11信号通路与L型钙离子通道参与特发性高钙尿症泌尿系结石形成机制初探

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 Ca2+促进IH患者肾小管原代细胞PRECs通过TGF-β1诱导EMT途径向骨相关表型分化

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

综述:EMT信号通路研究现况简述

附录 在校期间发表论文,参与课题以及参加会议情况

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