水通道蛋白在卵巢上皮性癌中的作用及其调节机制研究

摘要

卵巢上皮性癌(简称卵巢癌)由于病因及发病机制不明，发病隐匿，70％以上的卵巢癌患者就诊时已届晚期，治疗效果欠佳，积极开展卵巢癌病因学及发病机制研究的意义重大。 细胞内外水平衡是维持生命的关键因素之一，水的跨膜转运对维持细胞正常代谢具有重要作用。水通道蛋白家族(AQPs)是近年来发现的选择性转运水的跨膜蛋白，广泛分布于机体组织细胞，参与水的分泌、吸收及细胞内外的平衡。卵巢癌合并腹水是晚期病人的一大临床表现，是否存在水代谢方面的障碍尚不清楚，目前尚未见水通道蛋白与卵巢癌关系的报道。 水通道蛋白AQP1分布广泛，不仅存在于分泌及吸收上皮细胞，毛细血管及小血管内皮细胞中也很丰富，AQP1蛋白表达与毛细血管的通透性有关。AQP5主要表达于哺乳动物唾液腺、呼吸道黏膜和消化腺等腺体细胞的顶浆膜，在腺体分泌中有不可替代的作用。研究发现敲除AQP1基因的小鼠肺泡-毛细血管水的交换明显减少，微血管内皮细胞对水的通透性下降了十倍，AQP5基因敲除小鼠肺内渗透压依赖的被动性水转运被抑制90％。最近研究证明水通道蛋白过表达与结肠癌的发生及神经胶质瘤脑水肿有关。 NF-κB是一种核转录因子，广泛存在于多种细胞中，可与相关基因启动子或增强子特殊DNA序列结合，调控多种基因表达，与肿瘤发生、浸润和转移等关系密切。目前已有学者在AQP5的开放阅读窗上游找到NF-κB启动序列，NF-κB在卵巢癌中是持续性活化的，但核转录因子NF-κB是否调控卵巢癌细胞AQP5蛋白的表达尚不清楚。 为明确水通道蛋白AQP1和AQP5在卵巢癌中的作用及其调节机制，本文利用细胞培养、免疫组化、蛋白免疫印迹和PT-PCR技术从两个方面进行研究：1.水通道蛋白AQP1和AQP5在卵巢上皮性癌中的表达及其临床意义；2.卵巢癌SKOV3细胞AQP5蛋白表达的调节机制研究。 第一部分AQP1和AQP5蛋白在卵巢上皮性癌的表达及其临床意义方法：采用免疫组化、蛋白免疫印迹和RT-PCR技术检测65例卵巢上皮性肿瘤组织中AQP1和AQP5蛋白及mRNA的表达，并以13例正常卵巢组织为对照。结果：1.AQP1蛋白主要表达于卵巢上皮性肿瘤和正常卵巢组织的毛细血管和小血管内皮细胞的细胞膜上；AQP5主要表达于良性肿瘤细胞的基底膜，交界性肿瘤细胞的基底膜和顶浆膜，弥漫分布于卵巢癌细胞的胞膜上，在卵巢扁平上皮无表达或弱表达。2.卵巢癌及卵巢交界性上皮性肿瘤组织中AQP1和AQP5蛋白及mRNA表达水平明显高于卵巢良性上皮性肿瘤及正常卵巢组织(P＜0.05)；而卵巢癌与卵巢交界性上皮性肿瘤间、卵巢良性上皮性肿瘤与正常卵巢组织间比较均无统计学意义(P＞0.05)。3.卵巢癌腹水量≥1000ml者AQP1和AQP5蛋白和mRNA表达明显高于腹水量＜500ml者(P＜0.05)，伴淋巴转移者AQP5蛋白水平明显高于无淋巴转移者(P＜0.05)。4.Person相关分析显示：AQP1蛋白和mRNA表达与卵巢癌腹水量呈正相关关系(r=0.423，0.429；P＜0.05，P＜0.05)；AQP5蛋白和mRNA表达水平与卵巢癌腹水量(r=0.441，0.427；P＜0.01，P＜0.05)以及淋巴结转移呈正相关关系(r=0.410，0.361；P＜0.05，P＜0.05)。 第二部分卵巢癌SKOV3细胞AQP5蛋白表达调节机制的研究方法：采用细胞培养、MTT、免疫组化和蛋白免疫印迹技术检测卵巢癌腹水、顺铂以及核转录因子抑制剂PDTC对卵巢癌细胞株SKOV3生长状况、AQP5和核转录因子NF-κBp65以及其抑制因子IκBα蛋白表达的影响。 第一节卵巢癌腹水对SKOV3细胞AQP5、NF-κBp65和IκBα蛋白表达的影响结果：1.随着所取囊液或腹水来自卵巢肿瘤恶性程度的升高，SKOV3细胞生长率也明显增加，恶性组明显高于交界组(P＜0.001)，交界组明显高于良性组(P＜0.001)和对照组(P＜0.01)。2.恶性组NF-κBp65核/浆蛋白比值和胞浆NF-κBp65/IκBα蛋白比值明显高于对照组、良性组及交界组(P＜0.05)，但对照组、良性组和交界组三组间无显著差异(P＞0.05)。3.卵巢癌腹水培养的SKOV3细胞AQP5蛋白表达高于良性组和对照组(P＜0.05)，交界组明显高于良性组(P＜0.01)，对照组高于良性组(P＜0.05)。4.Person相关分析显示：SKOV3细胞生长率与AQP5蛋白表达、NF-κBp65核/浆蛋白比值和胞浆NF-κBp65/IκBα蛋白比值有明显的正相关关系(r=0.926，0.878，0.839；P＜0.001，0.001，0.01)；AQP5蛋白表达与NF-κBp65核/浆蛋白比值和胞浆p65/IκBα蛋白比值呈明显的正相关关系(r=0.658，0.622；P＜0.05，0.05)；NF-κBp65蛋白表达与IκBα有明显的正相关关系(r=0.839，P＜0.01)。 第二节顺铂对SKOV3细胞AQP5、NF-κBp65和IκBα蛋白表达的影响结果：1.随着顺铂剂量增加、作用时间延长，SKOV3细胞边缘变钝、变圆，突触减少，与邻近细胞脱离；SKOV3细胞生长抑制率也逐渐增加，且有时间及剂量依从性(P＜0.01)。2.随着顺铂浓度增加、作用时间延长，SKOV3细胞AQP5蛋白表达量越来越少(P＜0.001)，并可见AQP5蛋白表达于核膜上。3.随着顺铂浓度增加、作用时间延长，细胞浆和细胞核内NF-κBp65和IκBα蛋白表达越少(P＜0.001)，p65核/浆蛋白比值也明显下降(P＜0.001)。4.Person相关分析显示：顺铂对SKOV3细胞生长抑制率与AQP5、胞浆和胞核NF-κBp65蛋白表达以及p65核/浆蛋白比值有明显的负相关关系(r=-0.598，-0.835，-0.710，-0.815；P＜0.01，0.001，0.01，0.001)；AQP5蛋白表达与细胞浆NF-κBp65、IκBα以及p65核/浆蛋白比值呈明显正相关关系(r=0.894，0.857，0.883；P＜0.001，0.001，0.001)；NF-κBp65蛋白表达与IκBα有明显的正相关关系(r=0.934；P＜0.001)。 第三节PDTC对SKOV3细胞AQP5、NF-κBp65以及IκBα蛋白表达的影响结果：1.随着PDTC浓度增高、作用时间延长，对SKOV3细胞生长抑制率越来越高(P＜0.001)，且有时间及剂量依从性。2.随着PDTC浓度增加、作用时间延长，SKOV3细胞浆和胞核NF-κBp65和IκBα蛋白表达均明显减少(P＜0.001)。3.随着PDTC终浓度增加，作用时间延长，SKOV3细胞AQP5蛋白表达逐渐减少(P＜0.001)。4.Person相关分析显示：PDTC对SKOV3细胞生长抑制率与AQP5、细胞浆和胞核NF-κBp65蛋白表达呈明显的负相关关系(r=-0.983，-0.716，-0.744；P＜0.001，0.01，0.01)；AQP5蛋白表达与胞浆和胞核NF-κBp65以及胞浆IκBα呈明显的正相关关系(r=0.668，0.625，0.675；P＜0.05，0.05，0.05)，胞浆NF-κBp65与IκBα蛋白表达有明显的正相关关系(r=0.939；P＜0.001)。 结论：1.AQP1和AQP5蛋白定位于卵巢肿瘤组织中的不同细胞，前者位于微血管及小血管内皮细胞，后者位于卵巢肿瘤细胞，说明两者介导卵巢肿瘤组织中不同细胞的水跨膜转运。 2.卵巢癌组织中AQP1和AQP5蛋白表达上调可能与卵巢癌的发生、发展和预后有关。 3.卵巢癌微血管内皮AQP1和癌细胞AQP5蛋白表达上调，可能是卵巢癌腹水产生的原因之一。 4.卵巢癌腹水可激活SKOV3细胞核转录因子NF-κB，上调AQP5蛋白表达，促进细胞生长。 5.顺铂作用早期，可激活SKOV3细胞NF-κB，因此化疗时应注意药物剂量和用药时间，以防产生耐药。 6.顺铂作用晚期，可抑制SKOV3细胞核转录因子NF-κB，下调AQP5蛋白表达，抑制细胞生长。 7.核转录因子抑制剂PDTC下调SKOV3细胞NF-κBp65及IκBα蛋白表达，减少NF-κBp65蛋白核移位，抑制细胞增殖。 8.SKOV3细胞浆和细胞核NF-κBp65和IκBα蛋白表达是同步的，两者相互依存、相互调节。 9.核转录因子抑制剂PDTC下调SKOV3细胞AQP5蛋白表达，提示AQP5蛋白表达受NF-κB调控。

目录

前言

第一部分水通道蛋白AQP1和AQP5在卵巢上皮性癌的表达及其临床意义

第二部分卵巢癌SKOV3细胞AQP5蛋白表达调节机制的研究

第一节卵巢癌腹水对SKOV 3细胞生长、AQP5、NF-κB p65和IκBα蛋白表达的影响

第二节顺铂对SKOV3细胞生长、AQP5和NF-κB p65以及IκBα蛋白表达的影响

第三节PDTC对SKOV3细胞生长、AQP5、NF-κB p65和IκBα蛋白表达的影响

结论

水通道蛋白AQP1和AQP5的研究进展

附录 发表论文

致谢