Ox-LDL诱导早期巨噬细胞源泡沫细胞形成和损伤中相关动力学机制研究

摘要

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是一种多因素疾病，与多种危险因子包括血脂紊乱、糖尿病、肥胖和高血压有关，重要的基本病理改变是氧化低密度脂蛋白(oxidizedlow-densitylipoprotein，Ox-LDL)在血管壁的积聚，其中巨噬细胞在血管壁的脂质代谢中起着关键而复杂的作用。在早期脂质浸润中，巨噬细胞通过清道夫受体(CD36等)摄取Ox-LDL，形成泡沫细胞，大量积聚的Ox-LDL引起细胞毒性使细胞产生大量炎症因子，改变了细胞的形态和信号转导，进而损伤细胞影响动脉粥样硬化的发展。因此，早期AS最基本的病理特征之一就是巨噬源泡沫细胞的形成和损伤，但目前其形成和损伤的时间和空间动力学机理仍不清楚。 本研究以PMA诱导人单核细胞U937源的巨噬细胞为靶细胞，通过Ox-LDL诱导的巨噬细胞源泡沫细胞模型，利用流式细胞术、激光共聚焦显微术和分子生物学技术等实验技术，结合动力学分析方法，研究了动脉粥样硬化早期巨噬细胞源泡沫细胞形成和损伤的相关动力学机制。 本研究分别在Ox-LDL急性和慢性刺激等不同条件下，对影响泡沫细胞形成的部分关键因子胆固醇酯(CE)、总胆固醇(TC)、CD36、CD54和F-actin，以及[Ca2+]i等进行了时间和空间上的相关动力学研究。研究结果显示，1)在慢性刺激下，Ox-LDL能显著以时间依赖的方式诱导细胞内CE和TC的升高(P＜0.01)，尤其在24h时(CE/TC)％＞50％，表明了Ox-LDL诱导早期泡沫细胞形成的时间动力学变化，即Ox-LDL刺激24h后形成典型巨噬细胞源泡沫细胞；2)在急性和慢性刺激下，Ox-LDL能显著诱导[Ca2+]i的升高，但在急性刺激时，胞外液无论在有无Ca2+存在的情况下，[Ca2+]i都呈不同程度的升高，且在空间上形成明显的跨膜Ca2+梯度变化；3)在慢性刺激下，Ox-LDL以时间依赖的方式诱导细胞表面CD54和CD36表达的升高，以及F-actin时间和空间上多聚化的改变； 另外，本研究还分别在Ox-LDL急性和慢性刺激等不同条件下，对影响泡沫细胞内线粒体损伤的部分关键因子H2O2、NO和O2-、线粒体呼吸、线粒体膜电位(△ψm)、谷胱甘肽(GSH)和Bcl-2蛋白的表达、以及细胞的凋亡和坏死等进行了相关动力学研究。研究结果显示，1)在急性和慢性刺激下，Ox-LDL能显著以时间依赖的方式诱导细胞内NO和O2·-升高，动力学数据分析表明，在Ox-LDL急性刺激时，细胞内NO的升高明显高于O2·-的升高，且在2min以后细胞内O2·-的升高明显变缓，但急性刺激时细胞内H2O2则随时间持续升高，而在慢性刺激情况下24h时则显示明显降低；2)在慢性刺激时，Ox-LDL随时间诱导了线粒体呼吸的降低，△ψm的超极化，引起ROS和GSH的适应性升高，但在24h后则显示了△ψm部分去极化，ROS和GSH明显降低；3)在慢性刺激下，Ox-LDL显著以时间依赖的方式诱导细胞凋亡和坏死，12h和24h时细胞内Bcl-2蛋白表达同对照相比分别增加了500-600％和300-400％，但同12h相比Bcl-2表达在24h时有所下降。 综上所述，本研究的结论及主要创新点是：1)在早期巨噬细胞源泡沫细胞形成过程中，Ox-LDL诱导的[Ca2+]i快速升高是较早发生的细胞事件之一，使Ca2+能快速参与细胞功能的调节，同时细胞内随时间大量表达CD36和CD54等表面受体，细胞骨架蛋白发生空间和时间上多聚化改变，影响细胞的内吞和粘附，导致细胞在24h后形成典型泡沫细胞；2)在早期巨噬细胞源泡沫细胞损伤过程中，在12h内细胞内线粒体△ψm发生超极化，细胞内GSH适应性升高，并且启动了细胞核内基因转录表达了大量Bcl-2蛋白等细胞保护机制；同时又产生大量的RNS(NO)和ROS(O2-和H2O2等)等自由基，损伤线粒体呼吸，导致细胞凋亡和坏死；3)还发现随着细胞损伤的加剧，24h时线粒体△ψm有部分去极化，H2O2等ROS和GSH生成、以及Bcl-2蛋白表达随时间减少，线粒体呼吸、线粒体相关的细胞凋亡随时间进一步加重，表明线粒体功能的动态紊乱过程在早期动脉粥样硬化损伤中起着关键的作用。本研究利用时间和空间的动力学观点，阐释了早期巨噬细胞源泡沫细胞形成和损伤中多靶点、多网络的动态发病过程，提示在动脉粥样硬化早期的不同时间，调节相应靶点的代谢可能会有助于减轻损伤，并为动脉粥样硬化药物的研发提供一定的依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语词表

文献综述

第一章 引言

1.1动脉粥样硬化的基本病理生理

1.2动脉粥样硬化机理的研究进展

1.3动脉粥样硬化机制的研究方法

1.4本课题的研究目的、内容、方法、技术路线及意义

研究内容

第二章Ox-LDL诱导巨噬细胞源泡沫细胞模型的建立

2.1前言

2.2材料与方法

2.3实验结果

2.4分析与讨论

第三章Ox-LDL诱导巨噬细胞源泡沫细胞形成的相关动力学机制研究

3.1前言

3.2材料与方法

3.3实验结果

3.4分析与讨论

第四章Ox-LDL诱导巨噬细胞源泡沫细胞损伤的相关动力学机制研究

4.1前言

4.2材料与方法

4.3实验结果

4.3实验结果4.3.1急性Ox-LDL刺激对细胞内NO和O2·-动力学的影响

4.3实验结果4.3.2急性Ox-LDL刺激对细胞内H2O2的动力学的影响

4.3实验结果4.3.3慢性Ox-LDL刺激对细胞线粒体呼吸的影响

4.3实验结果4.3.4慢性Ox-LDL刺激对细胞内NO和O2·-的影响

4.3实验结果4.3.5慢性Ox-LDL刺激对细胞内H2O2影响

4.3实验结果4.3.6慢性Ox-LDL刺激对细胞内ROS影响

4.3实验结果4.3.7慢性Ox-LDL刺激对细胞内谷胱甘肽(GSH)的检测

4.3实验结果4.3.8慢性Ox-LDL刺激对细胞内线粒体跨膜电位(Δψm)的影响

4.3实验结果4.3.9慢性Ox-LDL刺激对细胞凋亡和坏死的影响

4.3实验结果4.3.10慢性Ox-LDL刺激对细胞内Bcl-2表达的影响

4.4分析与讨论

总结与展望

第五章总结与展望

5.1总结

5.2展望

参考文献

博士期间相关论文发表情况

致 谢