姬松茸多糖的分离纯化、结构鉴定及抗肿瘤活性研究

摘要

姬松茸(Agaricus Blazei Murill)原产于北美南部、巴西和秘鲁等地，是1972年日本人工栽培获得成功后才得以开发的一种食药兼用的名贵真菌。姬松茸具有浓郁的杏仁香味，菌盖嫩，菌柄脆，美味可口，含有丰富的蛋白质和其他营养成分，营养价值很高。姬松茸更为引人注目的是其医疗保健价值，因为多糖含量高，对抑制肿瘤(尤其是腹水癌)、增强精力、防治心血管病等都有效。姬松茸的子实体、菌丝体以及发酵液中均含有活性多糖。文献报道，姬松茸多糖具有抗肿瘤、增强免疫力、降血糖、改善糖尿病、降血压、降胆固醇、改善动脉硬化以及改善骨质疏松等作用。由于国内外对姬松茸多糖的研究侧重于粗多糖，对其中均一多糖组分的详细化学结构报道较少，为系统研究姬松茸多糖的化学结构和生物活性，对姬松茸子实体中的多种多糖组分以及姬松茸菌丝体和发酵液中的多糖进行了分离纯化、结构鉴定及药理活性研究。 本文共分六个部分，分别是子实体多糖的提取、菌丝体发酵和多糖分离纯化、不同来源的姬松茸成分比较、子实体多糖的分离纯化、姬松茸多糖理化性质和结构分析以及各种多糖的抗肿瘤活性研究。 取得的成果如下： 1、姬松茸子实体多糖的提取工艺研究 通过单因素试验和正交试验，确定了较佳的提取工艺，料水比为1：30；浸提温度：120℃；浸提时间：3h，物料浸提前用微波预处理8～12分钟可使多糖得率从8.12％提高到9.15％。提取次数以两次较经济，两次累计提取率可达93.10％。提取液浓缩后醇沉工艺条件为3倍体积95％乙醇醇沉6h。 2、姬松茸深层发酵及其多糖的提取纯化研究 本章通过对姬松茸深层发酵培养基和发酵工艺条件研究，旨在提高姬松茸菌丝体生物量以及胞外多糖的产量，为开展姬松茸菌丝体多糖和胞外多糖的生物活性研究打好基础，也为深层发酵替代子实体栽培提供理论依据。 2.1研究了不同培养基成分对姬松茸深层发酵的影响，结合工业化生产实际，选取农副产品原料玉米粉、豆饼粉为适宜的碳氮源。姬松茸深层培养较佳培养基组成为：蔗糖1％，玉米粉2％，豆饼粉0.5％，KH<,2>PO<,4> 0.3％和MgSO<,4>·7H<,2>O 0.2％。 2.2研究了不同培养条件对姬松茸深层发酵的影响，适宜的培养条件为：500mL摇瓶装液量100mL，接种量10％，转速120r/min，培养温度28℃，发酵周期140h。在此最佳条件下发酵，生物量可达1.21g/100mL，胞外多糖达到0.205g/100mL。 2.3参考子实体多糖的分离纯化方法，凝胶过滤法从姬松茸菌丝体中分离到两个多糖均一组分，命名为ABMM1和ABMM2，得率分别为34.5％和25.1％。 3、不同来源的姬松茸成分比较 3.1比较了姬松茸子实体和菌丝体的营养成分，菌丝体中总糖和蛋白质含量略高于子实体，而子实体的灰分高于菌丝体。 3.2通过等离子发射光谱法(ICP)测定了姬松茸子实体和菌丝体中的微量元素，发现姬松茸菌丝体及子实体中均富含多种人体必需微量元素，尤其是锌(Zn)和硒(Se)的含量较高。 3.3比较不同来源姬松茸粗多糖中多糖和蛋白质含量，子实体粗多糖中多糖含量高于菌丝体粗多糖，但蛋白质含量低于菌丝体粗多糖，但经水提工艺提取多糖，菌丝体粗多糖的得率却略高于子实体。 3.4比较不同来源的姬松茸粗多糖的HPLC谱图发现，菌丝体多糖和胞外多糖中分子量小的组分含量相对较高，而子实体粗多糖中分子量大的组分含量较高。 4、姬松茸子实体多糖的分离纯化研究 本章建立了姬松茸多糖纯化和分离的技术路线，主要步骤包括：超滤纯化、阴阳离子交换树脂法脱蛋白、分级醇沉和凝胶过滤层析等。 4.1试验结果表明：姬松茸多糖脱蛋白可采用如下工艺：姬松茸粗多糖溶液→1万分子量截留率膜超滤→截留液→过阴阳离子树脂交换柱→冻干→姬松茸脱蛋白多糖精粉。 4.2采用阴阳离子树脂法来脱除姬松茸多糖中的蛋白质效果相当理想，且未见国内外文献报道。用弱碱性阴和弱酸性阳离子交换树脂串联，去离子水洗脱，条件温和，起到部分脱色效果，用阴阳离子串联1次，蛋白脱除率可达89.7％，多糖回收率达到了82.1％。该法具有交换容量大、产业化放大容易、树脂可长期反复利用、工艺简单、生产成本低等诸多优点。 4.3通过分级醇沉可以将姬松茸多糖初步分为两个组分：命名为ABMF1和ABMF2，得率分别为48％和46％。通过Sepharose 6 F.F.凝胶过滤从ABMF1中分离得到两个多糖均一组分：分别命名为ABMPⅠ和ABMPⅡ。 4.4通过Seplaacryl S-300凝胶过滤从ABMF2中分离得到一个多糖均一组分，命名为ABMPⅢ，ABMPⅢ的含量为ABMF2的28.6％。 5、姬松茸子实体多糖单组分结构分析 5.1 姬松茸子实体多糖均一组分ABMP Ⅰ为白色固体，ABMP Ⅱ为微黄色固体，二者都易溶于水，它们的旋光度分别为+62.5°，+44.3°，分子量分别为>20×10<'5>，14×10<'5>。 5.2完全酸水解结合HPLC检测确定均一组分ABMP Ⅰ和ABMP Ⅱ都仅由葡萄糖单元组成。 5.3 ABMP Ⅰ是以1，4连接的吡喃型葡萄糖为主链并含有少量结合蛋白(1.5％)的非淀粉α葡聚糖。 5.4 ABMP Ⅱ可能是含有β-吡喃型葡萄糖基的蛋白聚糖。 6、姬松茸多糖的抗肿瘤活性研究 6.1姬松茸多糖ABMPⅠ、ABMP Ⅱ灌胃给药，对小鼠S180实体瘤均有一定的抑瘤作用，其中ABMPⅠ的抑瘤作用较ABMlPⅡ好。两个组分对小鼠S180实体瘤的抑制都呈现出剂量相关性，灌胃剂量为200 mg/kg·d时，ABMPⅠ的抑瘤率为46.3％；ABMPⅡ的抑瘤率为38.7％。 6.2姬松茸多糖ABMPⅠ、ABMPⅡ灌胃给药，对小鼠肝癌腹水实体瘤有较好的的抑瘤作用，其中ABMPⅠ的抑瘤作用较ABMPⅡ好。两个组分对小鼠肝癌腹水实体瘤的抑制都呈现出剂量相关性，灌胃剂量为200 mg/kg·d时，ABMPⅠ的抑瘤率为53.4％；ABMPⅡ的抑瘤率为40.1％。 6.3通过灌胃给药，姬松茸菌丝体粗多糖和姬松茸胞外多糖对小鼠S180实体瘤都有较好的抑制效果。姬松茸菌丝体粗多糖灌胃剂量为500 mg/kg·d时，抑瘤率为52.8％；姬松茸胞外多糖灌胃剂量为300 mg/kg·d时，姬松茸胞外多糖的抑瘤率为54.6％，当灌胃剂量增加时，抑瘤率反而下降，说明在高剂量下，姬松茸胞外多糖对小鼠的免疫系统有抑制作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号与缩略词等注释说明

第一章引言

1.1多糖的生物活性

1.1.1抗肿瘤活性

1.1.2免疫调节活性

1.1.3抗氧化活性

1.1.4抗病毒活性

1.1.5降血糖活性

1.1.6抗突变活性

1.1.7抗辐射活性

1.1.8抗衰老活性

1.1.9其他活性

1.2多糖的分离纯化方法

1.3多糖结构的解析方法

1.3.1分子量测定

1.3.2单糖组成测定

1.3.3单糖糖环形式测定

1.3.4单糖残基连接次序测定

1.3.5 α，β-异头异构形式测定

1.3.6糖残基上羟基取代测定

1.3.7取代基的位置

1.3.8糖链-肽链连接方式测定

1.4多糖的构效关系

1.4.1一级结构与活性的关系

1.4.2分子量与活性的关系

1.4.3高级结构与活性的关系

1.5多糖的结构修饰

1.5.1化学修饰

1.5.2生物方法修饰

1.5.3物理方法修饰

1.6姬松茸及其生物活性物质

1.6.1姬松茸的营养与保健价值

1.6.2姬松茸多糖的抗肿瘤作用

1.6.3姬松茸菌丝体及其生物活性物质

1.6.4姬松茸多糖国内外研究概况

1.7姬松茸多糖纯化和构效研究的意义

1.7.1研究意义

1.7.2目前多糖研究中存在的困难

1.7.3本文的主要研究内容

第二章姬松茸子实体多糖的提取研究

引言

2.1材料与方法

2.1.1原料、试剂材料及仪器

2.1.2实验方法

2.2结果与讨论

2.2.1子实体粉碎目数的研究

2.2.2热水浸提工艺的确定

2.2.3预处理方法的研究

2.2.4滤渣复提次数的确定

2.2.5醇沉工艺的确定

2.2.6按所定提取工艺的得率及所得粗粉的分析结果

2.3本章小结

2.3.1确定了姬松茸子实体多糖的水浸提工艺

2.3.2水浸提之前进行微波处理可提高多糖提取率

2.3.3姬松茸子实体多糖重复提取两次较为经济

2.3.4优化了姬松茸子实体多糖醇沉工艺

第三章姬松茸深层发酵研究及其多糖提取纯化

3.1实验材料

3.1.1原料

3.1.2主要试剂

3.1.3主要仪器

3.2实验方法

3.2.1培养基

3.2.2培养方法

3.2.3发酵参数测定

3.2.4菌丝体多糖的提取和分离

3.3实验结果

3.3.1碳源实验

3.3.2氮源实验

3.3.3培养基优化

3.3.4培养温度对生物量及胞外多糖的影响

3.3.5接种量对生物量和胞外多糖的影响

3.3.6摇瓶转速对生物量和胞外多糖的影响

3.3.7发酵周期对生物量和胞外多糖的影响

3.3.8姬松茸菌丝体多糖的分离

3.4本章小结

3.4.1确定了姬松茸深层培养较佳的培养基

3.4.2确定了姬松茸深层培养较佳的工艺条件

3.4.3分离得到两个姬松茸多糖组分

第四章不同来源的姬松茸成分比较

4.1实验材料

4.1.1原料

4.1.2主要试剂

4.1.3主要仪器

4.2实验方法

4.2.1水分测定

4.2.2粗蛋白测定

4.2.3粗灰分测定

4.2.4总糖含量测定

4.2.5粗多糖提取及得率

4.2.6凝胶过滤HPLC分析

4.3实验结果

4.3.1子实体与菌丝体比较

4.3.2粗多糖得率的比较

4.3.3粗多糖中蛋白质和多糖含量的比较

4.3.4不同来源粗多糖的液相图谱比较

4.4本章小结

4.4.1进行了姬松茸子实体和菌丝体的营养成分比较

4.4.2进行了不同来源(品种)姬松茸多糖和蛋白质的比较

4.4.3进行了各种姬松茸粗多糖的HPLC谱图分析

第五章姬松茸子实体多糖的分离纯化研究

5.1材料与方法

5.1.1原料、试剂材料及仪器

5.1.2实验方法

5.2结果与讨论

5.2.1超滤法纯化姬松茸粗多糖

5.2.2 Sevag法脱蛋白

5.2.3 Sevag法结合酶法脱蛋白

5.2.4三氯乙酸脱蛋白

5.2.5离子交换树脂脱蛋白

5.2.6 H2O2脱色

5.2.7分级醇沉分离纯化姬松茸多糖

5.2.8凝胶自备柱层析分离

5.2.9 ABMF2采用预装柱分离

5.3本章小结

5.3.1建立了姬松茸多糖分离纯化的技术路线

5.3.2采用分级醇沉和凝胶过滤等技术得到了几个未见报道的多糖单组分

第六章姬松茸子实体多糖单组分结构分析

6.1实验材料

6.1.1原料

6.1.2主要试剂

6.1.3主要仪器

6.2实验方法

6.2.1多糖组分纯度鉴定

6.2.2旋光度测定

6.2.3分子量测定

6.2.4单糖组成分析

6.2.5红外光谱分析

6.2.6甲基化分析

6.2.7核磁共振分析

6.3实验结果

6.3.1多糖组分纯度鉴定

6.3.2多糖组分理化性质

6.3.3分子量测定

6.3.4单糖组成分析

6.3.5红外光谱

6.3.6甲基化分析

6.3.7核磁共振

6.4本章小结

6.4.1初步测定了ABMP Ⅰ和ABMPⅡ的理化性质

6.4.2测定了ABMP Ⅰ和ABMPⅡ的单糖组成

6.4.3确定了ABMP Ⅰ葡萄糖残基之间的连接方式

6.4.4初步推断ABMPⅡ是蛋白聚糖

第七章姬松茸多糖的抗肿瘤活性研究

7.1实验材料

7.1.1原料

7.1.2实验动物

7.1.3环磷酰胺(CTX)

7.1.4瘤株

7.1.5主要试剂

7.1.6主要仪器

7.2实验方法

7.2.1 瘤细胞悬液的制备与接种

7.2.2分组

7.2.3给药

7.2.4疗效评价

7.2.5数据处理

7.3实验结果

7.3.1 ABMP Ⅰ、ABMPⅡ对小鼠S180实体瘤的抑制作用

7.3.2 ABMP Ⅰ、ABMPⅡ对肝癌腹水小鼠实体瘤的抑制作用

7.3.3姬松茸菌丝体粗多糖和胞外多糖对小鼠S180实体瘤的抑制作用

7.4本章小结

7.4.1 ABMP-Ⅰ、ABMPⅡ对小鼠S180实体瘤均有抑制作用

7.4.2ABMP-Ⅰ、ABMPⅡ对小鼠肝癌腹水实体瘤均有抑制作用

7.4.3菌丝体粗多糖和胞外多糖对小鼠S180实体瘤均有抑制作用

全文总结

1、姬松茸子实体多糖的提取工艺研究

2、姬松茸深层发酵及其多糖的提取纯化研究

3、不同来源的姬松茸成分比较

4、姬松茸子实体多糖的分离纯化研究

5、姬松茸子实体多糖单组分结构分析

6、姬松茸多糖的抗肿瘤活性研究

参考文献

致谢

作者简历