水稻RING指蛋白基因OsBIRF1和类丝氨酸羧肽酶基因OsBISCPL1的功能分析

摘要

植物抗病反应的调控涉及到复杂信号传导途径以及众多蛋白因子的协同作用。在研究水稻诱导免疫分子机理的过程中，分离鉴定了2个与水稻抗病反应相关的cDNA克隆BIHN-w1和BNHN-w3，分别编码RING-H2型RING指蛋白和丝氨酸羧肽酶类蛋白。本研究中，我们克隆了这2个cDNA克隆所代表的基因，OsBlRF1和OsBISCPL1，并研究了其生物学功能。 OsBIRF1基因全长为1873 bp，包含一个1191 bp的ORF，编码一个396个氨基酸的蛋白，含有一个高度保守的RING-H2型RING指结构域，是一个水稻RING-H2型RING指蛋白。OsBIRF1位于水稻第2条染色体上，不含内含子。RT-PCR结果分析表明，苯并噻二唑(benzothiadiazole，BTH)、水杨酸(salicylic acid，SA)、ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid)和茉莉酸(jasmonic acid，JA)等抗病信号分子能激活OsBIRF1的表达；在水稻与稻瘟病菌的非亲和性互作反应中OsBIRF1表现出明显的诱导表达，而在亲和性互作的感病水稻幼苗中只检测到相对较低水平的基础表达。为了进一步研究OsBIRF1在抗病反应中的功能，我们将OsBIRF1基因导入烟草，获得10株转OsBIRFl基因T0代烟草植株，其中5个株系(3，4，5，8，15)为单拷贝插入。RT-PCR结果分析表明所检测的OsBIRF1转基因烟草植株都能够正常表达。OsBIRF1转基因烟草植株不仅在长势方面比非转基因植株好，且明显提高了对烟草花叶病毒病和烟草野火病的抗性，诱导了烟草防卫反应相关基因PR-1、PR-2、PR-3和PR-5的上调表达。此外，转OsBIRF1基因烟草植株降低了对ABA的敏感性，提高了对氧化胁迫和干旱的抗性，但其抗盐性没有明显的变化。这些结果表明OsBIRF1在激活水稻抗病及抗逆反应中起作用。 OsBISCPL1基因全长cDNA为1747 bp，包含一个大小为1407 bp的ORF。OsBISCPL1位于水稻第8号染色体上，由12个外显子和11个内含子组成，在水稻基因组中以单拷贝的形式存在。OsBISCPL1编码一个由468个氨基酸组成的蛋白，属于类丝氨酸羧肽酶，其N-端1～29个氨基酸为信号肽序列，31～465个氨基酸是S10家族的肽酶序列，其中IvAESYGG是所有丝氨酸羧肽酶高度保守的丝氨酸活性位点。OsBISCPL1蛋白与拟南芥SCPL51遗传距离较近，在氨基酸水平上有53.6％的一致性。OsBISCPL1基因在水稻中的表达存在组织差异性，在根、叶和幼穗中表达量高，而在茎中较低。基因表达分析表明，BTH、SA、ACC和JA等抗病信号分子能激活OsBISCPL1基因的表达，在水稻与稻瘟病菌的非亲和性互作反应中OsBISCPL1基因上调表达。 利用根癌农杆菌介导的花序浸蘸法将OsBISCPL1导入拟南芥植株，获得13株转OsBISCPL1基因T1代拟南芥株系，其中5个株系为单拷贝插入。RT-PCR分析结果表明OsBISCPL1在所检测的转基因拟南芥T2代单拷贝植株中都能够正常表达。抗病性测定表明，OsBISCPL1转基因植株提高对Alternaria brassicicola、Pseudomonas syringae pv．tomato的抗性，而且这些转基因植株中防卫相关基因PR-1、PR-2、PR-5和PDF1.2都有组成型增强表达。 OsBISCPL1转基因植株在一定程度上降低了ABA敏感性，但对氧化胁迫表现出一定抗性。这些结果表明OsBISCPL1编码了一个水稻丝氨酸羧肽酶类蛋白，在植物抗病/抗逆反应中起作用。

目录

论文说明：图表目录

致谢

摘要

第一章文献综述和研究背景

1.1植物抗病反应与植物抗病信号传导途径

1.1.1植物的抗病反应

1.1.2植物抗病信号传导途径

1.2本研究的目的意义和主要研究内容

第二章水稻RING指蛋白基因OsBIRF1的克隆鉴定与功能分析

摘要

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1供试稻瘟菌菌株与接种

2.2.2水稻幼苗培育与处理

2.2.3水稻RING指蛋白基因OsBIRF1 cDNA的克隆

2.2.4 DNA的序列测定和分析

2.2.5水稻总RNA的提取

2.2.6 OsBIRF1在水稻抗病反应中差异表达的RT-PCR分析

2.2.7植物转化双元表达载体pCHF3-OsBIRF1的构建

2.2.8转OsBIRF1基因烟草植株的获得

2.2.9烟草基因组DNA及RNA的提取

2.2.10转基因烟草的分子鉴定

2.2.11转基因烟草植株中OsBIRF1基因和PR基因的表达分析

2.2.12 OsBIRF1转基因烟草生长状况

2.2.13 OsBIRF1转基因烟草植株抗病性测定

2.2.14 OsBIRF1转基因烟草种子对ABA的反应

2.2.15 OsBIRF1转基因烟草植株叶片抗盐性生物测定

2.2.16 OsBIRF1转基因烟草植株抗氧化胁迫测定

2.2.17 OsBIRF1转基因烟草种子抗旱性测定

2.2.18叶绿素含量的测定

2.3结果与分析

23.1 OsBIRF1基因全长cDNA序列的克隆及序列分析

2.3.2 OsBIRF1蛋白的结构与系统进化树分析

2.3.3 OsBIRF1基因在水稻抗病反应中的差异表达

2.3.4植物转化双元表达载体pCHF3-OsBIRF1的构建

2.3.5 OsBIRF1转基因烟草植株的获得

2.3.6 OsBIRF1转基因烟草植株的分子鉴定

2.3.7 OsBIRF1转基因烟草植株的生长状况

2.3.8 OsBIRF1转基因烟草植株提高抗病性

2.3.9 OsBIRF1转基因烟草植株中PR基因上调表达

2.3.10 OsBIRF1转基因烟草植株降低ABA敏感性

2.3.11 OsBIRF1转基因烟草植株的抗盐反应不变

2.3.12 OsBIRF1转基因烟草植株提高氧化胁迫抗性

2.3.13 OsBIRF1转基因烟草种子提高干旱抗性

2.4讨论

第三章水稻类丝氨酸羧肽酶基因OsBISCPL1的克隆鉴定与功能分析

摘要

3.1前言

3.2材料和方法

3.2.1供试水稻、病菌菌株、诱导处理及病菌接种

3.2.2水稻OsBISCPL1基因cDNA序列的克隆

3.2.3 DNA的序列测定和分析

3.2.4植物总RNA和基因组DNA的提取

3.2.5 OsBISCPL1在水稻不同组织中的差异表达

3.2.6 OsBISCPL1在水稻抗病反应中差异表达的RT-PCR分析

3.2.7水稻OsBISCPL1基因植物转化双元表达载体的构建

3.2.8拟南芥转化及转基因拟南芥植株的获得

3.2.9转基因拟南芥植株的分子鉴定

3.2.10转基因拟南芥植株中OsBISCPL1基因和PR基因的表达分析

3.2.11转OsBISCPL1基因拟南芥抗病性测定

3.2.12 OsBISCPL1转基因拟南芥种子对ABA的反应

3.2.13 OsBISCPL1基因转拟南芥抗氧化胁迫测定

3.3结果与分析

3.3.1 OsBlSCPL1基因全长cDNA序列的克隆及分析

3.3.2 OsBISCPL1蛋白的结构及系统进化树分析

3.3.3 OsBISCPL1基因在水稻不同组织和水稻抗病反应中的差异表达

3.3.4植物转化双元表达载体pCAMBIA991-OsBISCPL1的构建

3.3.5 OsBISCPL1转基因拟南芥的分子鉴定

3.3.6 OsBISCPL1转基因拟南芥植株提高抗病性

3.3.7转基因拟南芥植株中PR基因的上调表达

3.3.8 OsBISCPL1转基因拟南芥植株提高氧化胁迫抗性

3.3.9 OsBISCPL1转基因拟南芥植株降低ABA敏感性

3.4讨论

第四章全文小结和今后的研究

参考文献