超微量、高通量蛋白质结晶和筛选方法的研究

摘要

目前，X射线晶体衍射技术是现阶段最主要也是最可靠的蛋白质结构测定方法，而如何获得具有足够衍射分辨率的蛋白质晶体仍然是蛋白质结构研究的主要瓶颈问题。由于蛋白质结晶过程十分复杂，结晶条件的高通量筛选是获得蛋白质晶体的主要手段。基于微流控技术的蛋白质结晶筛选技术具有高通量、低消耗和集成化的优点，为蛋白质结晶的大规模筛选提供了重要的研究工具。
　　第一章综述了蛋白质结构研究的主要方法，并介绍了商品化的蛋白质结晶机器人;系统地综述了基于微流控芯片的蛋白质结晶技术的原理和实现方法。同时，对用于膜蛋白结晶的微流控技术也进行了介绍。
　　第二章的工作中，我们发展了一种基于顺序操作液滴阵列(SODA)技术的超微量、高通量、纳升级蛋白质结晶筛选系统。在此基础上，发展了等体积连续试样加入和变体积连续试样加入两种新型液滴操作模式，并将其应用于蛋白质结晶和筛选方法的研究。采用该方法，我们成功筛选了5种水溶性蛋白的结晶条件，单次实验共生成288个液滴结晶反应器，蛋白质溶液的总消耗量仅为0.6μL，与商品化筛选系统相比，蛋白质消耗量降低了2-3个数量级。我们还系统地研究了不同液滴体积对蛋白质结晶行为的影响，首次观察到晶体数量和晶体生长速度与液滴体积的关系。还利用该系统生成一个9×9的液滴阵列，进行蛋白质二维结晶相图的快速测定。蛋白质消耗量为200nL，总耗时仅需9min。此外，我们还成功将该系统应用于实际膜蛋白样品—MscL的结晶条件筛选显示了该系统在蛋白质结晶领域具有广阔的应用前景。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

§1．1 引言

§1．1．1 蛋白质结构测定方法

§1．1．2 商品化的蛋白质结晶仪器

§1．2 基于微流控技术的蛋白质结晶筛选方法

§1．2．1 基于PDMS薄膜的徼泵微阀技术

§1．2．2 微流控液滴技术

§1．2．3 滑动芯片(SlipChip)

§1．2．4 其他系统

§1．3 基于微流控技术的膜蛋白结晶方法

§1．3．1 基于去垢剂的微流控膜蛋白结晶

§1．3．2 基于脂质立方相的微流控膜蛋白结晶

§1．4 小结与选题意义

参考文献

第二章 基于顺序操作液滴阵列(SODA)技术的高通量纳升级蛋白质结晶筛选方法的研究

§2．1 引言

§2．2 实验部分

§2．2．1 实验试剂与材料

§2．2．3 仪器设备

§2．2．4 芯片加工

§2．2．5 毛细管探针加工

§2．2．6 实验操作

§2．3 结果与讨论

§2．3．1 蛋白质结晶条件筛选系统的液滴生成及操控性能

§2．3．2 交叉污染

§2．3．3 大规模蛋白质结晶条件筛选

§2．3．4 液滴体积对蛋白质结晶行为的影响

§2．3．5 膜蛋白的结晶

§2．3．6 二维液滴阵列用于蛋白质结晶相圈的快速测定

§2．4 结论与展望

参考文献

附表

作者简历

攻读硕士期间所取得的科研成果