截短侧耳素产生菌的微量培养方法和其高产菌的高通量筛选方法

摘要

本发明提供一种截短侧耳素产生菌的微量培养方法，步骤如下：将截短侧耳素产生菌经培养后分离单菌落；配制固体发酵培养基高压灭菌后加入酶标板的各孔中，将截短侧耳素产生菌的单菌落菌丝体接种于酶标板中培养7-9天。本发明还提供截短侧耳素高产菌的高通量筛选方法，步骤如下：将经微量培养的截短侧耳素产生菌的酶标板孔中加入提取液提取，每孔吸取提取液进行转板，加入显色剂显色，用酶标仪测定并分析结果，得到筛选后的截短侧耳素高产菌。由于采用固体发酵，简化了种子培养这一步骤，发酵时间大大缩短。应用本发明的高通量筛选方法和普通的筛选方法相比相关系数良好，可知本发明的高通量筛选方法能应用于截短侧耳素高产菌的筛选。

说明书

技术领域

本发明涉及截短侧耳素产生菌的微量培养方法和其高产菌的高通量筛选方法。

背景技术

截短侧耳素类衍生物有沃尼妙林、泰妙菌素等，主要作为预混剂添加于动物饲料中，不仅有预防猪疟疾和肺炎的作用，还可以增加肉猪产量。截短侧耳素类抗生素在生产实践中的作用日渐突出，其发酵研究也逐渐成为研究热点，为了提高发酵产量，选育高产菌株是截短侧耳素类抗生素应用的突破点。

目前高通量的微生物微量培养和检测方法正逐步成为菌种筛选的主要方式，但各种微生物的微量培养方法不同，针对截短侧耳素产生菌的一类高等担子真菌的微量培养方法还没有被完善的建立起来；快速检测技术主要是基于高通量的酶标仪光学检测，但有效、快速、准确的针对截短侧耳素类抗生素等二萜烯类物质的微量检测方法也未见报道。

将酶标仪检测技术应用于高通量的高产菌种筛选的关键在于，产物出现稳定的特征吸收峰以及产物高效的转板问题。只有将微量培养和酶标仪检测相结合才能够很好的解决这一问题，而目前的微量培养以及高通量检测技术均不适用于截短侧耳素产生菌一类的高等担子真菌，以及其特殊的二萜烯类结构。

发明内容

本发明提供一种截短侧耳素产生菌的微量培养方法，本发明还提供截短侧耳素高产菌的高通量筛选方法。

为了实现上述目的本发明提供一种截短侧耳素产生菌的微量培养方法，所述微量培养方法的步骤如下：

1）、将截短侧耳素产生菌稀释成菌悬液，涂布于平板，培养后分离单菌落；

2）、配制固体发酵培养基：以下为质量百分含量：葡萄糖5.7%、玉米浆4%、大豆油0.4%、MgSO₄0.04%、大豆蛋白胨1%、琼脂粉1.5%，其余为水；

3）、将步骤2）中的固体发酵培养基高压灭菌后在无菌环境中将其加入酶标板，每孔加入量为孔体积的1/3-2/3； 

4）、将步骤1）中形成的截短侧耳素产生菌的单菌落菌丝体接种于步骤3）中制备的酶标板中，于25℃培养7-9天，完成截短侧耳素产生菌的微量培养。

进一步地，步骤3）中所述固体发酵培养基的每孔加入量为孔体积的1/2。

本发明还提供一种截短侧耳素高产菌的高通量筛选方法，所述高通量筛选方法的步骤如下：

1） 将截短侧耳素产生菌稀释成菌悬液，涂布于平板，培养后分离单菌落；

2）、配制固体发酵培养基：以下为质量百分含量：葡萄糖5.7%、玉米浆4%、大豆油0.4%、MgSO₄0.04%、大豆蛋白胨1%、琼脂粉1.5%，其余为水；

3）、将步骤2）中的固体发酵培养基高压灭菌后在无菌环境中将其加入酶标板，每孔加入量为孔体积的1/3-2/3；

4）、将步骤1）中形成的截短侧耳素产生菌的单菌落菌丝体接种于步骤3）中制备的酶标板中，于25℃培养7-9天；

5）、在步骤4）的每孔中加入50-100μl甲醇或乙醇提取；

6）、每孔吸取一定量提取液，转板于另一酶标板中；

7）、向每孔加入浓硫酸显色，所述浓硫酸的体积大于等于提取液的体积；

8）、将每孔稀释相同倍数，吸取稀释液转板于另一酶标板中，在450nm-460nm波长处进行酶标仪的紫外吸收测定，分析测定结果，得到筛选后的截短侧耳素高产菌。

进一步地，步骤3）中所述固体发酵培养基的每孔加入量为孔体积的1/2。

进一步地，步骤7）中所述浓硫酸的体积与提取液的体积相同。此时可保证截短侧耳素在显色充分的同时浓硫酸用量最少。

进一步地，步骤8）中的稀释倍数为10-100倍。此时可以保证稀释后的提取液浓度在酶标仪的检测范围内。

进一步地，步骤8）中在455nm波长处进行酶标仪的紫外吸收测定。

进一步地，步骤5）中提取时间为5-20分钟。

进一步地，步骤5）中提取时间为10分钟。

本发明的技术方案的技术效果如下：

1.     提供了一种截短侧耳素产生菌的微量培养方法。由于高通量单菌落转接培养，各个孔间没有交叉影响，并且菌落生长环境高度一致，营养条件受到制约，在这种情况下，产量高低完全取决于菌种本身的遗传基因。

2.     由于采用固体发酵技术，发酵过程简化，静止培养过程中不需要过多调整培养基等条件，使各个单菌落间培养条件在整个发酵过程中保持一致，减少了人为操作等处理带来的误差。固体发酵培养基的每孔加入量为孔体积的1/3-2/3时，既可以保证菌体足够的生长营养需要，又留有足够的空间，保证氧气供应。

3.     由于采用多孔板培养，使原来的实验室培养规模得到大大增加，采用96孔酶标板培养，一人次可以转接1000个菌株以上，每轮筛选效率提高了100倍以上，并且能够保证所有一次转接菌株培养条件的一致性。

4.     由于采用固体发酵，简化了种子培养这一步骤，直接进行发酵，发酵时间大大缩短，传统发酵周期缩短一半，每个月可进行四轮筛选，且培养条件更加易于操控。

5.     由于整个过程只有一次传代培养，对于遗传背景易受环境影响的微生物，减少了多次传代遗传背景变化的几率，能够将高产量菌种快速分离，得到更好的保持。

6.     截短侧耳素提取方便，只用一种试剂就可以完成提取：截短侧耳素高度溶解于甲醇或乙醇。且在微量环境中，过量的提取剂还会破坏细胞壁结构，使截短侧耳素提取的更加充分，更好的体现产量的高低。

7.     提取时间短，5分钟即可将微孔板中截短侧耳素提取至溶剂中，微量化避免了提取的不完全，结果更加可靠。

8.     提取液转板使截短侧耳素快速与培养条件分离，培养时间相同，检测环境统一；显色反应同时进行，显色时间短，过量的显色剂使所有截短侧耳素充分显色，因此，使用酶标仪检测到的截短侧耳素含量即为发酵得到的截短侧耳素产生菌中的截短侧耳素含量。

9.     提取得到的截短侧耳素经过浓硫酸的显色反应，生成有色物质，避免了其他干扰物质对测定截短侧耳素产量的影响，且显色时间短，20s-60s就可完成显色，浓硫酸的体积大于等于提取液的体积时，可以确保显色充分。浓硫酸是萜类物质的特定显色物质，应用浓硫酸进行显色使生成的产物具有稳定的特征吸收峰，进一步增加结果的可信度。

10.  反应结束后立即进行酶标仪紫外吸收的测定，每96孔酶标板测定时间为2秒，短时间内可以进行大量酶标板的测定，目前高效液相测定为一次12分钟测定一个样品，本发明的酶标仪测定方法检测的效率是用高效液相检测的效率的34560倍。

11.  整个过程在各个环节进行了高通量化，以及时间的压缩，在一人操作情况下筛选效率大幅度提高：高通量发酵时间是原来发酵时间的一半；一人可以操作10个96孔微孔板共计发酵菌株960个，常规摇瓶发酵最多一次操作12个菌株，发酵过程效率提高了2×960/12=160；测定过程效率是原来的34560倍，筛选效率是原来筛选效率的34560×160=5529600倍，并且能够保证结果的准确性。

附图说明

图1是应用本发明的高通量筛选方法与应用普通的筛选方法（摇瓶发酵筛选、高效液相色谱测定的方法）数据对比图。其中，横坐标为挑选出的截短侧耳素高产菌的菌株编号，纵坐标为截短侧耳素浓度（μg/ml），颜色深的柱体表示的是应用本发明的高通量筛选方法得到的截短侧耳素浓度，颜色浅的柱体表示的是应用普通的筛选方法得到的截短侧耳素浓度。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。

本发明中所使用的试剂如下：

截短侧耳素产生菌菌株：产自保加利亚，型号HK-101；

固体发酵培养基每100克中包含：葡萄糖5.7g、玉米浆4g、大豆油0.4g、MgSO₄0.04g、大豆蛋白胨1g、琼脂粉1.5g，水87.36g；

96孔酶标板。

实施例1

截短侧耳素产生菌的微量培养步骤如下：

（1） 用无菌水将截短侧耳素产生菌稀释10倍，制成菌悬液，涂布于平板，25℃培养3-5天，分离单菌落；

（2） 制备含有1/2固体发酵培养基的96孔酶标板备用：将固体发酵培养基121℃高压灭菌15分钟，在超净台中无菌操作将其加入96孔酶标板，每孔加入量150μl；

（3） 用竹签挑取步骤（1）中形成的截短侧耳素产生菌的单菌落菌丝体，将其接种于含有固体发酵培养基的96孔酶标板中，复板一次，留作摇瓶鉴定使用；

（4）  将接种后的96孔酶标板于25℃培养7天，完成截短侧耳素产生菌的微量培养。

截短侧耳素高产菌的高通量筛选方法如下：

（1）  在上述含有经过微量培养后的截短侧耳素产生菌的酶标板孔中每孔加入100μl甲醇，提取10分钟；

（2）  提取结束后，每孔吸取50μl提取液，转板于另一96孔酶标板中；

（3）  向每孔加入50μl浓硫酸，使之充分显色反应，显色时间为20s，反应结束后，将每孔稀释10倍，吸取200μl稀释液转板于另一96孔酶标板中，在455nm处进行酶标仪的紫外吸收测定；

（4）  紫外吸收测定的OD值如表1所示，OD值越高代表截短侧耳素浓度越大，从中挑选出OD值高的孔，共挑选出11个，这11个孔相对应的菌株为筛选出的截短侧耳素高产菌，截短侧耳素高产菌在96孔酶标板中的位置序号按OD值高低依次为：B1O,C11，C8，H6，H7，E9，C9，B9,,H5，C10，G7。将其由1-11进行编号。

                              表1

 。

 下面用摇瓶发酵筛选、高效液相色谱测定的方法对截短侧耳素高产菌进行验证：

（1）  取保存的截短侧耳素产生菌的复板，根据表1所示的菌株位置，将11株截短侧耳素高产菌株（即位置序号依次为B1O,C11，C8，H6，H7，E9，C9，B9,,H5，C10，G7的菌株）挑出，分别用5ml无菌水将其制成菌液，涂布于斜面培养基。斜面培养基的成分为：葡萄糖5.7g、玉米浆4g、大豆油0.4g、MgSO₄0.04g、大豆蛋白胨1g、琼脂粉1.5g，水87.36g；

（2）  待菌落长满斜面，用接种铲铲取约2cm²菌块，用5ml无菌水将其制成菌液接种于种子培养基进行摇瓶培养。种子培养基配方：豆粉7g、Ca(NO₃)₂0.05g、CaCO₃0.05g，水92.9g。种子培养条件为25℃，转速220rmp，培养时间三天；

（3）  种子培养后，将种子液按照体积比10%接入发酵培养基。发酵培养基每100g含以下成分：葡萄糖5.7g、玉米浆4g、大豆油0.4g、MgSO₄0.04g、大豆蛋白胨1g，水88.86g。发酵培养温度为25℃，转速220rmp，培养时间9天；

（4）  发酵结束后，每瓶取发酵液2.5ml，用甲醇定容于25ml容量瓶，超声波提取30分钟，过滤，将滤液进行高效液相色谱测定，结果如图1所示。

由图1可知：应用本发明的高通量筛选方法和普通的筛选方法（摇瓶发酵筛选、高效液相色谱测定的方法）结果之间相关系数r=0.8656，p＜0.01，其中r为皮尔森相关系数，p为差异显著概率。两者相关系性良好。因此，本发明的高通量筛选方法能代替普通的筛选方法进行截短侧耳素高产菌的筛选。

实施例2

截短侧耳素产生菌的微量培养步骤如下：

（1） 用无菌水将截短侧耳素产生菌稀释至100倍，制成菌悬液，涂布于平板，25℃培养3-5天，分离单菌落；

（2）  制备含有1/3固体发酵培养基的96孔酶标板备用：将固体发酵培养基121℃高压灭菌15分钟，在超净台中无菌操作将其加入96孔酶标板，每孔加入量100μl；

（3）  用接种环挑取步骤（1）中形成的截短侧耳素产生菌的单菌落菌丝体，将其接种于含有固体发酵培养基的96孔酶标板中；

（4）  将接种后的96孔酶标板于25℃培养8天，完成截短侧耳素产生菌的微量培养。

截短侧耳素高产菌的高通量筛选方法如下：

（1）  在上述含有经过微量培养后的截短侧耳素产生菌的酶标板孔中每孔加入100μl乙醇，提取5分钟；

（2）  提取结束后，每孔吸取40μl提取液，转板于另一96孔酶标板中；

（3）  向每孔加入80μl浓硫酸，使之充分显色反应，显色时间为40s，反应结束后，将每孔稀释50倍，吸取200μl稀释液转板于另一96孔酶标板中，在450nm处进行酶标仪的紫外吸收测定，OD值高的孔相对应的菌株为筛选出的截短侧耳素高产菌。

实施例3

截短侧耳素产生菌的微量培养步骤如下：

（1）  用无菌水将截短侧耳素产生菌稀释至1000倍，制成菌悬液，涂布于平板，25℃培养3-5天，分离单菌落；

（2）  制备含有2/3固体发酵培养基的96孔酶标板备用：将固体发酵培养基121℃高压灭菌15分钟，在超净台中无菌操作将其加入96孔酶标板，每孔加入量200μl；

（3）   用接种针挑取步骤（1）中形成的截短侧耳素产生菌的单菌落菌丝体，将其接种于含有固体发酵培养基的96孔酶标板中；

（4）   将接种后的96孔酶标板于25℃培养9天，完成截短侧耳素产生菌的微量培养。

截短侧耳素高产菌的高通量筛选方法如下：

（1）  在上述含有经过微量培养后的截短侧耳素产生菌的酶标板孔中每孔加入100μl甲醇，提取20分钟；

（2）  提取结束后，每孔吸取60μl提取液，转板于另一96孔酶标板中；

（3）  向每孔加入80μl浓硫酸，使之充分显色反应，显色时间为1min，反应结束后，将每孔稀释100倍，吸取200μl稀释液转板于另一96孔酶标板中，在460nm处进行酶标仪的紫外吸收测定，OD值高的孔相对应的菌株为筛选出的截短侧耳素高产菌。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。