siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物对SKOV3细胞Notch1基因沉默作用的研究

摘要

目的:本文利用基因干扰技术来抑制人卵巢癌SKOV3细胞Notch1基因的表达，在细胞水平上进行Notch1基因敲除效率的评估。虽然基因干扰技术有着巨大的潜力，然而，siRNA易降解的特性限制其临床应用，并且siRNA递送系统仍然存在着诸多缺陷，如转染效率低、稳定性差等问题。所以，设计高效、稳定、安全的Notch1 siRNA载药系统对增强抗卵巢癌作用具有非常重要的意义。本文合成N-(N，N'-二甲基)丙基丁二酸单胆固醇酯单酰胺(DMAPA-CHEMS)阳离子胆固醇材料，合用大豆卵磷脂S100制备阳离子脂质体，并对其制剂学特征，在核酸酶和血清中的稳定性，细胞毒性，细胞摄取效率，Notch1 mRNA沉默和Notch1蛋白下调效率，增殖和凋亡方面进行了评价，为构建安全有效的siRNA载体系统提供了强有力的理论基础。
　　方法:利用胆固醇、丁二酸酐、N，N-二甲基丙二胺(DMAPA)、DCC和NHS合成DMAPA-CHEMS，与大豆磷脂S100采用薄膜法制备阳离子脂质体。利用动态激光散射仪(DLS)测DMAPA-CHEMS阳离子脂质体粒径和电位，透射电镜观察形态。1.5％琼脂糖凝胶电泳分析脂质体在0.1mg/mL RNase和25％ FBS环境中对siRNA保护作用。采用 CCK-8试剂盒考察了DMAPA-CHEMS阳离子脂质体和N,C-siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物细胞毒性，流式细胞仪和激光共聚焦显微镜考察了SKOV3对siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物的摄取，利用荧光定量PCR和Western Blot评价了Notch1-siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物对Notch1基因的沉默效率。最后采用CCK-8试剂盒考查了Notch1-siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物对SKOV3细胞增殖的影响，细胞凋亡试剂盒测定Notch1-siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物对SKOV3细胞凋亡的影响。
　　结果:siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物的粒径随N/P比增加而减小。N/P=100时，粒径(100.94±3.72) nm，电位(46.54±4.32) mV。透射电镜显示其为圆形或类圆形。RNase和血清稳定性试验中，可以看到载体可以显著提高siRNA稳定性。流式细胞仪结果显示随N/P比增加，细胞摄取增加，N/P=100时，摄取达到最大值。激光共聚焦显微镜结果显示SKOV3细胞对siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物摄取效率高。荧光定量PCR结果表明N/P=100时，对SKOV3细胞Notch1mRNA表达抑制最大，其2-△△Ct为0.34±0.04，明显低于空白组0.94±0.07。WesternBlot结果显示转染Notch1-siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物24小时后即可见SKOV3细胞Notch1蛋白表达明显下调，转染72 h后蛋白表达为(26.47±6.23)％，显著低于对照组(100.00±11.02)％。CCK-8试剂盒检测细胞毒性实验可以看到DMAPA-CHEMS阳离子脂质体的细胞毒性较小，浓度＜100μ g/mL时，转染后24 h、48 h或72 h，细胞存活率都高于80％。结果表明，DMAPA-CHEMS阳离子脂质体作为基因运送载体，本身并无明显的细胞毒性，但是Notch1-siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物对SKOV3细胞的增殖具有明显的抑制作用，N/P比100时，转染72 h后，细胞存活率下降到(60.45±2.24)％，与阴性对照(86.43±0.87)％有显著差异。细胞凋亡实验结果显示Notch1-siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物对SKOV3细胞的凋亡有明显促进作用。
　　结论:本研究所制备的siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物具有较小的粒径，表面带正电荷，形态为圆形或类圆形。核酸酶和血清蛋白环境中具有良好的siRNA稳定性，细胞毒性小，具有较高的细胞摄取率，较强的靶基因沉默和蛋白下调效率。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词

第一章 绪论

1．1 研究背景

1．2 立题依据

第二章 DMAPA-CHEMS脂质体构建和性质考察

2．1 仪器和材料

2．1．1 主要仪器

2．1．2 主要材料

2．2 方法与操作

2．2．1 DMAPA-CHEMS的制备

2．2．2 DMAPA-CHEMS阳离子脂质体的制备

2．2．3 脂质体形态表征

2．2．4 粒径和Zeta电位测定

2．2．5 RNase稳定性和血清稳定性试验

2．3 结果和讨论

2．3．1 粒径、Zeta电位和形态测定

2．3．2 RNase稳定性和FBS稳定性试验

2．4 本章小结

第三章 SKOV3细胞对siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物的摄取及体外评价

3．1 仪器与材料

3．1．1 主要仪器

3．1．2 主要材料

3．1．3 细胞株

3．2 溶液的配制

3．3 方法和操作

3．3．1 细胞的传代培养

3．3．2 细胞的转染

3．3．3 细胞摄取实验

3．3．4 荧光实时定量PCR检测Notch1 mRNA的表达

3．3．5 Western Blot检测Notch1蛋白表达

3．3．6 细胞毒性和增殖实验

3．3．7 细胞凋亡实验

3．4 实验结果和讨论

3．4．1 实验细胞和Notch1 siRNA序列的筛选

3．4．2 细胞摄取实验

3．4．3 Notchl-siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物对Notch1-mRNA表达的影

3．4．4 Western Blot检测Notch1蛋白表达

3．4．5 细胞毒性实验和增殖实验

3．4．6 细胞凋亡实验

3．5 本章小结

全文总结

参考文献

文献综述 siRNA非病毒纳米载药系统研究

个人简历

攻读学位期间发表文章情况