TLR3信号通路在人卵巢颗粒细胞内源性抗病毒反应中的作用研究

摘要

Toll样受体(TLRs)是天然免疫系统的重要组成部分，是一类重要的模式识别受体，能识别病原体相关模式分子、引起炎性介质的释放。TLR3识别病毒来源的dsRNA及其拟似物Poly(I∶C)，在机体抗病毒免疫反应中起重要作用。人类卵巢组织可被不同的病毒感染，卵母细胞及卵泡液中都曾发现有病毒感染存在。排卵和分泌性激素是卵巢的两大主要功能。卵巢颗粒细胞的重要作用是合成雌二醇、以及为卵母细胞提供营养物质。
　　目的：研究人卵巢组织及颗粒细胞TLR3的表达情况及其在内源性抗病毒反应过程中的作用，进一步探讨病毒感染对卵巢排卵及内分泌功能的影响。
　　方法：收集因输卵管因素或男性因素不孕在浙江大学医学院附属妇产科医院生殖中心接受IVF-ET的患者取卵后的卵泡液，分离、体外培养。免疫组织化学及免疫细胞化学方法检测TLR3在卵巢组织及颗粒细胞中的表达;以FSH和（或）Poly(I∶C)刺激后检测细胞增殖活力;不同时间点终止培养收集上清及细胞，ELISA法检测培养上清中的细胞因子IL-6、IL-8、RANTES(regulated uponactivation normal T cell expressed and secreted，调节活化正常T细胞表达与分泌的趋化因子，又名CCL5）水平;电化学发光法检测上清中的雌二醇浓度;荧光定量PCR检测TLR3 mRNA表达水平及雌二醇合成关键酶P450芳香化酶mRNA表达水平的变化;Western blot检测TLR3及P450芳香化酶蛋白表达水平。
　　结果：TLR3在人卵巢颗粒细胞中固有表达，Poly(I∶ C)刺激后TLR3 mRNA表达上调(P＜0.05)，FSH刺激对TLR3的表达无明显影响;FSH提高颗粒细胞的增生活力， Poly(I∶C)或Poly(I∶C)与FSH联合处理对颗粒细胞活力的影响与对照组无统计学差异;Poly(I∶ C)刺激颗粒细胞后炎症因子IL-6、IL-8及RANTES分泌增加，在48小时内表现为明显的时间依赖效应;Poly(I∶ C)与FSH联合处理与单独FSH处理相比，培养基中E2的浓度下降，差异具有统计学意义。Poly(I∶C)与FSH联合处理与单独FSH处理相比， P450芳香化酶mRNA和蛋白的表达水平下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论：TLR3在人卵巢颗粒细胞中固有表达。体外病毒拟似物Poly(I∶C)刺激颗粒细胞后，诱导TLR3表达上调，及其下游炎症因子释放增加。Poly(I∶C)对FSH诱导颗粒细胞合成雌激素的过程具有抑制作用，该作用通过抑制P450芳香化酶的表达而实现。综上，推测卵巢病毒感染可以激活颗粒细胞TLR3信号通路、诱导免疫反应、抑制雌二醇的合成，最终导致卵巢功能失调和卵子质量下降。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

1 引言

2 材料与方法

2．1 研究对象

2．2 细胞培养

2．3 免疫组织化学及免疫细胞化学检测TLR3在人类卵巢组织及颗粒细胞中的表达情况

2．4 CCK-8检测Poly(I：C)对细胞增殖和生存活力的影响

2．5 ELISA法检测Poly(I：C)刺激颗粒细胞后上清中IL-6，IL-8及RANTES的表达水平

2．6 电化学发光法测定Poly(I：C)刺激颗粒细胞后培养上清中雌二醇的分泌情况

2．7 实时荧光定量PCR检测Poly(I：C)刺激颗粒细胞后TLR3及P450芳香化酶的表达

2．8 Western blot检测检测Poly(I：C)刺激颖粒细胞后P450芳香化酶的表达水平

2．9 统计学分析

3 结果

3．1 TLR3在人卵巢组织及颗粒细胞中的表达情况

3．2 Poly(I：C)诱导颗粒细胞中TLR3表达增加

3．3 Poly(I：C)对颗粒细胞增殖活力的影响

3．4 Poly(I：C)诱导颗粒细胞炎症因子及趋化因子分泌增加

3．5 Poly(I：C)抑制FSH诱导的颗粒细胞E2的分泌

3．6 Poly(I：C)对颗粒细胞P450芳香化酶表达的影响

4 讨论

5 结论

参考文献

综述 TOLL样受体与卵巢功能的关系研究进展

作者简历及科研成果