基于TLR3/4信号通路探讨栝楼桂枝汤调控脑卒中后炎症反应的作用机制研究

摘要

目的：
　　基于TLR3/4信号通路通过体内外实验探讨栝楼桂枝汤调控脑卒中后炎症反应的作用机制。
　　方法：
　　1.健康清洁级SD大鼠（90只）随机分为假手术组，MCAO模型组，中药栝楼桂枝汤干预组，共3组。模型组和中药组行大脑中动脉缺血再灌注模型(MCAO)的制备，假手术组只分离动脉，不结扎、插线。造模后，进行神经行为学评分、Ashworth肌张力评级、Catwalk步态分析和TTC染色检测，鉴定模型成功与否。所有大鼠回笼饲养，假手术组和模型组不予任何治疗，中药干预组大鼠在术后第二天用栝楼桂枝汤(1.16g/ml)灌胃，1次/d，共7d。栝楼桂枝汤干预结束后，进行腹腔采血和大脑皮层组织取材。采用Greiss反应和ELISA法检测大鼠外周血清中相关炎症介质的分泌水平;通过RT-PCR和Western-blotting法、免疫组化法检测炎症通路上的相关蛋白的表达水平;应用EMSA法、DNA-bindingELISA实验检测炎症通路上转录因子的活化水平。
　　2.体外制备LPS刺激小胶质细胞BV2的炎症细胞模型，用栝楼桂枝汤的水提液进行干预。通过MTT实验筛选最佳的干预浓度，以对细胞无毒性为筛选标准，界定LPS和栝楼桂枝汤的最佳干预浓度或浓度区间。栝楼桂枝汤水提液干预结束后，取细胞培养上清并提取细胞总RNA和蛋白。应用Griess反应和ELISA法检测NO和炎症因子的分泌水平;通过RT-PCR和Western-blotting法检测炎症通路上的相关蛋白的表达水平;应用激光共聚焦显微镜、DNA-binding ELISA实验观察和检测炎症通路上转录因子的活化水平。制备小胶质细胞条件培养基干预PC12细胞，采用MTT实验和免疫荧光染色法观察栝楼桂枝汤对PC12细胞的生长活力和形态的影响。
　　结果：
　　1.栝楼桂枝汤可显著改善MCAO大鼠的神经行为学缺陷和运动功能，并可显著降低MCAO大鼠的梗死体积，同时抑制患侧脑组织的炎症浸润及神经元死亡和炎症细胞的活化。
　　2.栝楼桂枝汤可显著降低MCAO大鼠外周血中促炎因子的表达水平，促进抗炎因子的表达。同时栝楼桂枝汤可抑制通路NFκB上相关蛋白的表达及NFκB的活化水平，促进通路IRF3上相关蛋白的表达及IRF3的活化。
　　3.栝楼桂枝汤水提液在体外可抑制小胶质细胞BV2的活化和炎症因子的分泌及促进抗炎因子的产生。栝楼桂枝汤可抑制活化小胶质细胞中炎症通路相关蛋白的表达及NFκB的活化水平，促进IRF3通路相关蛋白的表达及其活化有关。
　　4.小胶质细胞条件培养基可抑制PC12细胞的生长，而栝楼桂枝汤可保护PC12细胞免于条件培养基的损伤作用。
　　结论：
　　研究结果表明，栝楼桂枝汤对脑卒中所致的脑缺血再灌注损伤及其所致的运动功能障碍有较好的改善作用，其机制可能与调控TLR3/4介导的脑卒中后神经炎症有关。

目录

声明

缩略词表

摘要

前言

第一部 分栝楼桂枝汤对MCAO大鼠神经炎症反应的抑制作用

1 目的

2 材料

2．1 动物

2．2 药物

2．3 试剂

2．4 仪器

2．5 主要试剂的配制

3 研究方法

3．1 中药的制备

3．2 MCAO大鼠模型的制备

3．3 中药干预与动物分组方法

3．4 TTC法检测大脑梗死体积

3．5 神经行为学评分

3．6 改良Ashworth肌张力分级评定法

3．7 动物步态分析系统检测大鼠的运动功能

3．8 动物取材

3．9 ELISA法检测大鼠外周血炎症因子的变化

3．10 Griess法检测大鼠外周血中的NO含量

3．11 组织病理学观察神经元损伤情况和炎症反应

3．12 免疫组化法检测免疫炎症细胞的特异性标记及炎症通路相关蛋白的表达

3．13 RT-PCR法检测炎症相关基因的表达情况

3．14 Western-blotting法检测炎症通路相关蛋白的表达水平

3．15 EMSA法检测NFκB的活化情况

3．16 DNA-binding ELISA法检测IRF3的活化水平

3．17 统计学分析

4 结果

4．1 栝楼桂枝汤能降低MCAO大鼠的脑梗死体积

4．2 栝楼桂枝汤能改善MCAO大鼠的神经行为缺陷

4．3 栝楼桂枝汤能促进MCAO大鼠痉挛状态和运动功能的恢复

4．4 栝楼桂枝汤能降低MCAO大鼠外周血炎症因子的表达

4．5 栝楼桂枝汤能减轻MCAO大鼠的炎症细胞浸润及活化

4．6 栝楼桂枝汤对MCAO大鼠脑组织中TLR通路相关基因表达的影响

4．7 栝楼桂枝汤对MCAO大鼠脑缺血组织中TLR通路相关蛋白表达的影响

4．8 栝楼桂枝汤对MCAO大鼠脑缺血组织中TLR通路转录因子活化的影响

5 讨论

5．1 栝楼桂枝汤的临床治疗作用

5．2 MCAO模型的制备与鉴定

5．3 TLR信号通路在脑卒中后炎症中的关键作用

5．4 栝楼桂枝汤对TLR3／4炎症信号通路的调控作用

6 小结

第二部分 栝楼桂枝汤对活化小胶质细胞的药理作用研究

1 目的

2 材料

2．1 细胞

2．2 药物

2．3 试剂

2．4 仪器

2．5 主要试剂的配制

3 研究方法

3．1 栝楼桂枝汤水提液的制备

3．2 细胞培养

3．3 MTT法筛选药物干预浓度，建立炎症细胞模型

3．4 栝楼桂枝汤水提液处理活化小胶质细胞的方式

3．5 ELISA法检测细胞培养上清中的炎症因子

3．6 Griess法检测细胞培养上清中的NO含量

3．7 PCR实验检测炎症相关基因的表达水平

3．8 Western-blotting实验检测炎症相关蛋白的表达水平

3．9 激光共聚焦显微镜观察转录因子NFlcB的核转位情况

3．10 DNA-binding ELISA法检测转录因子IRF3的活化情况

3．11 小胶质细胞条件培养基的制备

3．12 PC12细胞生长活力的检测

3．13 PC12细胞的形态学观察

3．14 统计学分析

4 结果

4．1 栝楼桂枝汤对小胶质细胞生长活力的影响

4．2 栝楼桂枝汤对小胶质细胞炎症介质表达水平的影响

4．3 栝楼桂枝汤对炎症相关通路蛋白表达水平的影响

4．4 栝楼桂枝汤对活化小胶质细胞中转录因子活性的影响

4．5 栝楼桂枝汤对小胶质细胞条件培养基所致PC12损伤的影响

5 讨论

5．1 小胶质细胞在脑卒中后神经系统炎症中的关键作用

5．2 体外小胶质细胞炎症细胞模型的制备

5．3 栝楼桂枝汤对活化小胶质细胞中炎症通路的调控作用

5．4 栝楼桂枝汤对小胶质细胞条件培养基所致PCI2损伤的保护作用

6 小结

结论

参考文献

致谢

综述