4-差向土霉素对大鼠的毒性及其肠道菌群与代谢组学影响的研究

摘要

自上世纪五十年代以来，抗生素一直被广泛应用于治疗和防御动物或人类的各种感染性疾病。但随着抗生素用量不断增加，抗生素滥用已引起全球性环境及健康问题。尽管抗生素作为一种新兴污染物已被广泛关注，但抗生素代谢产物的安全性及毒理效应却很少有系统研究。土霉素(OTC)作为使用量最大的抗生素之一，其母体化合物及其主要代谢产物4-差向土霉素(4-EOTC)都经常在环境中检测到。本研究以OTC主要代谢产物4-EOTC为研究对象，通过对Wistar大鼠连续灌胃不同剂量的4-EOTC(0.5、5.0和50mg/kg bw)15d，系统研究其对大鼠的毒性、肠道菌群及代谢组学的影响，主要结果如下：
　　1)通过灌胃实验研究了不同剂量4-EOTC对大鼠毒性影响及其在大鼠血液及尿液中的残留规律。结合血液学、血清生化及组织病理学结果，发现4-EOTC可以影响大鼠正常的肝血清功能，低剂量（0.5mg/kg bw）即可对大鼠肝脏产生病理作用，高剂量时作用显著(p＜0.05)，同时肝脏和肾脏出现脂肪变性、细胞点状坏死、肾小球流出等病理现象，推测肝、肾是4-EOTC发挥毒性作用的靶器官。另外，利用高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)方法分析4-EOTC在给药期间及给药后两周内在大鼠血液和尿液中的残留及变化规律，发现在给药期间其残留量呈累积增加趋势，停止给药两周后，大鼠尿液及血液中仍可检测到其残留，说明4-EOTC可在大鼠机体组织或器官中发生残留和累积，可能会对机体正常生理代谢产生潜在而持久的不良影响，并严重威胁生物体的健康。
　　2)采用Illumina高通量测序并结合多元变量分析研究4-EOTC灌胃后大鼠肠道菌群变化规律。4-EOTC灌胃可改变肠道菌群组成，如增加大鼠肠道菌群中放线菌门尤其是双歧杆菌科的相对含量，而厚壁菌门和拟杆菌门相对含量减少;主成分分析(PCA)及Cluster分析发现中剂量和高剂量4-EOTC处理组与对照组差异明显，说明4-EOTC可明显改变大鼠肠道菌群结构。通过Q-PCR方法对大鼠肠道菌群中抗生素抗性基因及16S rRNA基因进行定量，发现中剂量及高剂量4-EOTC可以明显提高抗生素抗性基因tetQ、tetO的相对含量，这些基因在肠道菌群中可发生转移扩散，引起肠道菌群中抗生素抗性菌比例增加，导致微生物耐药性增加，对生物体健康产生潜在影响。
　　3)采用超高相液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)方法分析了不同剂量4-EOTC处理15d后大鼠血液和尿液代谢组学的变化。PLS-DA结果表明，连续摄入4-EOTC可对大鼠机体的正常代谢功能产生影响，处理组尤其是高剂量组和中剂量组与对照组大鼠血液及尿液样品的分布规律有明显差异;另外，结合VIP值、t-检验等分析发现大鼠尿液中氨基乙酸、6-磷酸葡萄糖及牛磺酸等代谢产物含量变化显著，说明4-EOTC可引起大鼠机体糖代谢功能的紊乱;赖氨酸、精氨酸等氨基酸代谢产物含量的显著变化说明大鼠氨基酸代谢也受到4-EOTC的影响;另外，4-EOTC处理后大鼠体内脂肪酸代谢也发现显著变化，包括LysoPCs、DG、PG等长链、短链脂肪酸含量的改变。
　　综上，4-EOTC作为OTC主要代谢产物的一种，通过研究其对大鼠毒理学、肠道菌群及代谢组学的影响及其在大鼠体内的代谢残留规律，说明高剂量摄入可对机体产生毒性影响，并改变正常肠道菌群功能，引起机体代谢功能紊乱，对机体健康有潜在威胁。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1．1 抗生素及其代谢产物概述

1．1．1 抗生素的来源及分类

1．1．2 抗生素的使用现状

1．1．3 抗生素及其代谢产物的危害

1．2 抗生素与肠道菌群的研究进展

1．2．1 肠道菌群概述

1．2．2 肠道菌群的主要研究方法

1．2．3 抗生素及其代谢产物与肠道菌群

1．3 代谢组学研究进展

1．3．1 代谢组学简介

1．3．2 代谢组学的研究及分析方法

1．3．3 代谢组学研究的应用

1．4 研究目的、意义及主要内容

1．4．1 研究目的和意义

1．4．2 主要研究内容及技术路线

第二章 4-EOTC对大鼠的毒性影响及其在大鼠体内的残留规律分析

2．1 材料和方法

2．1．1 主要试剂与仪器

2．1．2 实验动物及采样

2．1．3 4-EOTC代谢残留规律研究方法

2．2 实验结果

2．2．1 4-EOTC对大鼠毒性影响

2．2．2 4-EOTC在大鼠体内的残留规律

2．3 讨论

2．3 本章小结

第三章 大鼠肠道菌群及抗性基因对4-EOTC的响应

3．1 材料与方法

3．1．1 实验设计、样品收集及基因组提取

3．1．2 16S rRNA基因V4片段扩增

3．1．3 高通量测序及序列分析

3．1．4 多变量统计分析

3．1．5 抗性基因的绝对荧光定量

3．2 结果与分析

3．2．1 大鼠肠道菌群对不同浓度4-EOTC的响应分析

3．2．2 抗性基因对4-EOTC的响应

3．3 讨论

3．3 本章小结

第四章 4-EOTC对大鼠血液和尿液代谢组学的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 实验动物及样品采集

4．1．2 UPLC-Q-TOF／MS检测条件

4．1．3 实验及分析方法

4．2 实验结果

4．2．1 样品前处理方法的筛选

4．2．2 尿液代谢组学变化分析

4．2．3 血液代谢组学变化分析

4．3 讨论

4．4 本章小结

第五章 论文总结

5．1 论文主要研究结论

5．2 论文主要创新之处

5．3 论文不足与展望

参考文献

攻读硕士期间研究成果