表皮松解性掌跖角化症基因突变敲入小鼠的表型分析及靶向shRNA治疗的探索

摘要

背景:表皮松解性掌跖角化症(epidermolytic palmoplantar keratoderma，EPPK。OMIM:144200)属于一种较为常见的常染色体显性皮肤遗传病，是高度遗传异质性的掌跖角化症最为常见的亚型。EPPK的主要致病基因为表达角蛋白9(keratin9，K9)分子的KRT9基因，少数病例由KRT1基因突变引起。EPPK患者出生后数周到数月内即逐渐开始出现典型的临床症状，并持续终生。主要临床表现为整个手掌和脚掌表皮的弥漫性角质增厚，色黄，在增厚的表皮周边有明显的红斑缘，许多患者伴多汗、臭汗症。某些患者还伴发指节垫、断指或先天性指屈曲等症状。目前，EPPK尚无有效的治疗手段。国内外的绝大多数研究报道尚聚焦于EPPK的变异组学。
　　目的:在完善小鼠KRT9基因突变敲入模型表型分析的基础上，探索一种可行、高效的EPPK个性化基因治疗方案，为EPPK的后续临床基因治疗、用药治疗等研究奠定基础。
　　方法:
　　(1)本课题组前期已报道发现几个南方汉族EPPK家系特有一种KRT9基因indel突变类型:c.500_500delAinsGGCT(p.Tyr167delinsTrpLeu)，并据此通过基因打靶技术构建了Krt9/c.434delAinsGGCT(p.Tyr144delinsTrpLeu)突变敲入小鼠模型。本研究进一步对突变小鼠的足底皮肤进行深入的表型和病理学分析（H&E染色、电镜观察等），以确定模型小鼠的EPPK样病理改变;并从分子角度分析突变小鼠的足底皮肤组织K9蛋白的变化，以及K9蛋白的突变对其他蛋白质表达的影响。
　　(2)分别构建人和小鼠的萤火虫荧光素酶报告基因野生型和c.434delAinsGGCT突变型萤火虫荧光素酶慢病毒表达载体，即pfLUC-Homo-ex1KRT9/c.500delAinsGGCT/wt(pfLUC-ex1KRT9-mutant/wt)和pfLUC-Mus-ex1Krt9-c.434delAinsGGCT/wt(pfLUC-ex1Krt9-mutant/wt)，以荧光素酶报告实验为依据，按照EPPK患者和c.434delAinsGGCT突变小鼠的角蛋白9基因序列设计16条候选siRNA分子，筛选并验证功能性和特异性相对最好的靶向治疗siRNA，以达到敲降突变的Krt9等位基因表达量而对正常Krt9等位基因无影响或影响极小的目的。依据所筛选的siRNA序列，构建特异性靶向治疗shRNA慢病毒载体（即lv-sh-K9mut-8），以人永生化角质形成细胞系HaCat为对象，用lv-sh-K9mut-8对其进行转染，观察有无脱靶效应。
　　(3)将慢病毒载体候选靶向shRNA(lv-sh-K9mut-8)注射治疗12周龄的Krt9+/mut突变杂合小鼠，观察EPPK样病理症状是否得到缓解等表型变化;从组织病理和分子水平上分析治疗后的角化增生症状是否得到改善;分析靶向shRNA(lv-sh-K9mut-8)是否引发了不良的免疫反应。
　　结果:
　　(1) Krt9/c.434delAinsGGCT(p.Tyr144delinsTrpLeu)突变敲入杂合性成年小鼠的前、后爪在11～12周时出现稳定、明显的EPPK样病理表型。H&E染色显示足垫凸起处表皮增厚、表皮扩张和角化过度症状，乳头状瘤状增生，显著的颗粒细胞增多症和棘皮症，以及具有不典型形状的表皮上部中的空泡化细胞。透射电镜超微结构分析显示，角化细胞的细胞裂解和表皮的基底层中的纤维丝的异常聚集。免疫荧光染色显示，K9突变小鼠足垫中PCNA和p63阳性细胞的数量和染色强度增加;应激反应和创伤愈合角蛋白K6和K16在Krt9+/mut和Krt9mut/mut小鼠中的表达显著高于Krt9+/+野生型小鼠;表达于基底上层的角蛋白K1和K10因K9的功能障碍而显著增高，并具有局部扩张和异常聚集的现象。免疫印迹试验（Western blot）分析显示，Krt9+/+和Krt9+/mut小鼠的K2表达量与野生型小鼠相比减少了60％。
　　(2)以Krt9/c.434delAinsGGCT和KR T9/c.500delAinsGGC小插缺突变为靶向siRNA治疗的研究对象，经16条候选siRNA分子验证之后，发现si-K9mut-8的功能性和特异性相对效应最好，仅敲降突变K9分子，而对正常K9蛋白影响极小。因此，以si-K9mut-8分子的碱基序列设计合成了慢病毒表达shRNA载体(lv-sh-K9mut-8)，转染HaCat细胞系，进一步明确lv-sh-K9mut-8对突变KRT9基因的靶向抑制效率。实验结果表明，si-K9mut-8无明显的脱靶效应。
　　(3)Krt9+/mut突变杂合小鼠第10天和20天各1次的候选靶向shRNA注射治疗之后，肉眼可见病鼠的角化过度症状减轻，显示了表型上的治疗改观;检测治疗后的突变小鼠的前爪足垫突起处组织的增殖蛋白标记（PCNA、p63、involucrin和filaggrin）和细胞骨架角蛋白分子(K10、K1、K6、K16、K14、K5和K2e)，发现shRNA治疗部分修复了病鼠的病理学改变，而没有引起明显的不良免疫应激反应。
　　结论:靶向特异性shRNA可能是一种具有较大潜力的EPPK个性化基因治疗方案，并可为其他单基因遗传性皮肤病的基因治疗提供思路和借鉴。

目录

声明

致谢

摘要

英文缩略词

第一章 引言

1．1 角蛋白

1．2 EPPK的致病突变基因

1．3 EPPK的基因治疗进展

第二章 表皮松解性掌跖角化症疾病模型的表型分析

2．1 实验目的

2．2 实验材料和方法

2．2．1 主要仪器

2．2．2 主要试剂

2．2．3 实验动物

2．2．4 常用实验试剂的配制

2．2．5 实验方法

2．3 实验结果

2．4 结论

2．5 讨论

第三章 靶向特异性siRNA的筛选和靶向特异性shRNA慢病毒载体的构建

3．1 实验目的

3．2 实验材料和方法

3．2．1 主要试剂

3．2．2 主要仪器

3．2．3 实验质粒、菌株及细胞株

3．2．4 主要实验试剂的配置

3．2．5 实验方法

3．3 实验结果

3．4 结论

3．5 讨论

第四章 靶向治疗shRNA分子的疗效评估

4．1 实验目的

4．2 实验材料和方法

4．2．1 主要试剂

4．2．2 实验试剂的配置

4．2．3 实验器材

4．2．4 实验方法

4．3 实验结果

4．4 结论

4．5 讨论

参考文献

第六章 综述：遗传性皮肤病的基因治疗进展

博士在读期间发表的SCI论文