一种人表皮松解性掌跖角化症小鼠模型的构建方法

摘要

本发明公开了一种人表皮松解性掌跖角化症小鼠模型的构建方法，将小鼠Krt9基因第434位核苷酸的A突变为GGCT，构建SEQ ID NO:1所示含有重组Krt9基因的打靶质粒载体，筛选携带有重组Krt9基因的小鼠，即为所述人表皮松解性掌跖角化症小鼠模型；本发明利用基因打靶技术产生，筛选到了国际上首个Krt9基因敲入突变的小鼠品系，即Krt9-indel小鼠，发现模型小鼠的表型与人EPPK完全一致，从而得到一个从基因到表型完全模仿人EPPK的特异动物模型，可进一步广泛用于人EPPK的致病病因、病理机制等研究，以及对EPPK治疗药物的筛选和基因治疗试验等。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种Krt9基因的特异位点c.434delAinsGGCT突变动物模型的构建方法以及动物模型在人表皮松解性掌跖角化症中的应用。

(二)背景技术

小鼠(Mus musculus)是一种非常好的可用于研究人类疾病的致病病因、分子机制、药物以及治疗方法的动物模型。基因打靶胚胎干细胞法是通过同源重组部分替换小鼠打靶基因的DNA序列，所产生的小鼠的表型是这部分DNA序列重要功能的反映。由基因打靶技术获得的动物模型，可用以从整体观察实验动物，推测相应基因的功能，因而这项技术得到了国际公认，发明该技术的三位科学家Capecchi、Smithies和Evans获得了2007年的诺贝尔医学奖。迄今，通过基因打靶技术建立的人类疾病小鼠模型已超过500多种。这些模型的建立，极大地丰富了人类对疾病相关基因功能的了解，为疾病机制的研究、新药研发和治疗方案评价提供了重要的宝贵的遗传资源。

表皮松解性掌跖角化症(epidermolytic palmoplantar keratoderma，EPPK。OMIM：144200)是一种相对常见的致残性常染色体显性遗传性皮肤病，也是最常见的掌跖角化症亚型。EPPK患者出生后数周到数月即有表征，持续终生。临床表现为掌、跖的整个表皮有弥漫性的角质增厚，表面光滑，色黄，在增厚的周边有明显的红斑缘。手掌和脚掌易皲裂，产生疼痛感。症状加剧时，手指活动困难。某些EPPK患者可伴有指节垫、先天性指屈曲和断指等症状。组织病理学检查可见在表皮上基底棘层和颗粒层的角质形成细胞的核周边形成空泡及细胞裂解，电镜观察有角蛋白和张力丝的异常聚集物。Covello等(1988)对北爱尔兰进行的流行病学调查数据显示，EPPK的发病率为4.4/100000。由于本病呈常染色体显性遗传方式，患者生育患病子代的风险高达50％。目前，临床上尚未出现有效的治疗EPPK方法。因此，EPPK严重影响患者的工作、生活质量、婚姻和家庭，带给患者及其家属终身的痛苦。

角蛋白9基因(KRT9)是EPPK的主要致病基因，外显率为100％。根据国际人类中间丝数据库(Human Intermediate Filament Database，www.interfil.org)截止2014年6月的统计数据，在多个种族或民族的EPPK家系或散发病例中已经发现了27种不同的KRT9基因，包括23种错义/无义突变、2种插入突变、1种缺失突变和1种小插缺突变(small indel)。KRT9基因第1外显子第500位核苷酸的碱基小插缺(indel)突变(c.500delAinsGGCT)，将导致K9分子第167位酪氨酸缺失并插入色氨酸和亮氨酸(p.Tyr167delinsTrpLeu)，为KRT9基因首次报道的插缺突变类型。indel突变是一类相对罕见的基因突变类型。截止2014年4月的统计数据，在HGMD中收录的indel仅占所收录基因突变总数的1.46％。绝大多数的indel与人类疾病相关，它们很少作为DNA多态性存在于健康人群中。因此，indel的生成机制可能更为复杂，其在疾病发生中的意义远大于DNA点突变。带有同源的Krt9基因c.434delAinsGGCT突变的小鼠，其表型与人EPPK十分相似，因而是一种非常好的人EPPK的疾病模型。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种利用基因打靶技术产生Krt9基因突变的小鼠，从而产生一种人表皮松解性掌跖角化症动物模型的方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种人EPPK小鼠模型的构建方法，所述方法为：(1)将小鼠Krt9基因第434位的A突变为GGCT，构建SEQ ID NO:1所示含有重组Krt9基因的打靶载体质粒；(2)将含有重组Krt9基因的打靶载体质粒电转入小鼠胚胎干细胞，得到携带有重组Krt9基因的小鼠胚胎干细胞；(3)将携带有重组Krt9基因的小鼠胚胎干细胞显微注射入白化的小鼠囊胚期细胞中，将注射完毕后的囊胚期细胞移入假孕母鼠(优选2.5d)子宫内待产，移植后(优选第17.5天)获得嵌合鼠；(4)将嵌合率>50％的雄性嵌合体小鼠与野生型C57BL/6J雌性小鼠合笼，繁殖产生下一代小鼠，筛选携带有重组Krt9基因的小鼠，即为模拟人表皮松解性掌跖角化症的小鼠模型。

进一步，优选所述小鼠为C57BL/6N品系小鼠。

进一步，重组Krt9基因质粒载体构建的技术路线为：

(1)以Krt9-BAC质粒为模板，在引物PCR1F和PCR1R、PCR2F和PCR2R、PCR3F和PCR3R的作用下进行PCR扩增，分别获得扩增产物Krt9-PCR1、扩增产物Krt9-PCR2和扩增产物Krt9-PCR3；将Krt9-PCR1与载体PL253连接形成质粒Krt9-PCR1-PL253，再将扩增产物Krt9-PCR2与质粒Krt9-PCR1-PL253通过双酶切后进行连接，形成质粒Krt9-PCR1-PCR2-PL253，然后将扩增产物Krt9-PCR3与质粒Krt9-PCR1-PCR2-PL253经双酶切后进行连接，形成质粒Krt9-PCR1-PCR2-PCR3-PL253；

(2)将pUC57-krt9CDS载体的第434位的核苷酸A突变为GGCT，形成片段Krt9-5ARM；然后以Krt9-BAC质粒为模板，在引物Krt9-3Arm-F和引物Krt9-3Arm-R的作用下进行PCR扩增，合成扩增产物Krt9-3ARM；将片段Krt9-5ARM和扩增产物Krt9-3ARM与载体PL452连接，形成质粒Krt9-3ARM-5ARM-PL452；

(3)将质粒Krt9-3ARM-5ARM-PL452与质粒Krt9-PCR1-PCR2-PCR3-PL253通过同源重组形成Krt9-突变-loxp-neo-loxp-PL253载体，然后再将Krt9-突变-loxp-neo-loxp-PL253载体进行BstZ17I酶切改造，去除上述步骤(1)三片段PCR扩增产物连接时启动子区引入的BstZ17I酶切位点，获得用于小鼠胚胎干细胞基因打靶的含有重组Krt9基因的终载体，核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

进一步，小鼠胚胎干细胞打靶生成模拟人EPPK的小鼠模型的技术路线为：

(1)上述所构建的与人EPPK患者携带的KRT9突变c.500delAinsGGCT同源性的小鼠Krt9基因c.434delAinsGGCT突变打靶载体中，包含用于筛选阳性中靶小鼠胚胎干细胞克隆的药筛作用元件loxP-NEO/Kan-loxP片段。用Not I处理质粒，使之线性化，将欲转入小鼠胚胎干细胞的质粒载体的DNA浓度调整约为1μg/μl；

(2)将Krt9基因c.434delAinsGGCT突变打靶载体电转入C57BL/6N小鼠胚胎干细胞，挑选同时抗遗传霉素(G418)和丙氧鸟苷(GANC)的单克隆小鼠胚胎干细胞，并通过PCR反应、Sanger DNA测序和Southern杂交，得到携带有Krt9基因c.434delAinsGGCT突变的阳性中靶小鼠胚胎干细胞；

(3)将携带有Krt9基因c.434delAinsGGCT突变的阳性中靶C57BL/6N小鼠胚胎干细胞显微注射入白化的C57BL/6小鼠囊胚期细胞中，将注射完毕后的囊胚移入2.5d的假孕母鼠子宫内待产，移植后的第17.5天获得Krt9基因c.434delAinsGGCT突变嵌合C57BL/6小鼠；

(4)挑选“步骤(3)”中嵌合率>50％的雄性嵌合体小鼠，与野生型C57BL/6J雌性小鼠合笼，繁殖产生下一代小鼠。对新生小鼠进行基因型-表型筛选，得到携带重组Krt9基因且足垫区皮肤发育异常的小鼠，即获得人表皮松解性掌跖角化症小鼠模型。

本发明构建的Krt9基因敲入小鼠模型在出生后3～4周即出现前、后爪足垫区皮肤黑色过度角化斑，且随着时间的推移更加趋向明显，表型出现增厚-蜕皮-增厚的变化，周期为3周左右。表明该模型小鼠在表型上高度模拟人EPPK的临床表现。小鼠的基因型包括纯合子、杂合子与野生型。迄今，国内外文献报道、专利数据库和包括世界最大的小鼠资源中心美国Jackson研究所在内的动物模型目录中，均未见相关EPPK/Krt9基因敲入小鼠的信息。因此，本发明的小鼠模型可广泛用于人EPPK疾病的致病病因、病理机制等研究，用于筛选突变特异性靶向治疗小干扰RNA分子药物及其他基因治疗的研究。

本发明的有益效果：本发明利用基因打靶技术产生，筛选到了国际上首个Krt9基因敲入(knock-in)突变的小鼠品系，即Krt9-indel小鼠。发现模型小鼠的表型与人EPPK完全一致，从而得到一个从基因到表型完全模仿人EPPK的特异动物模型，可进一步广泛用于人EPPK的致病病因、病理机制等研究，以及对EPPK治疗药物的筛选和基因治疗试验等。

(四)附图说明

图1Krt9-indel小鼠的基因型鉴定结果说明，a：分别用两对引物进行PCR后的凝胶电泳图。1号引物扩增条带只有在阳性突变杂合小鼠中存在，条带大小为503bp。而2号引物扩增条带在阳性突变杂合小鼠中表现为2个条带(483bp和361bp)，而在野生型小鼠中只有1个条带(361bp)。2K+为DNA分子量Maker；b：野生型(wt)，杂合子(KI/wt)和纯合子(KI/KI)小鼠突变位点DNA测序结果。由测序峰图可见(方框所示)，野生型小鼠为正常的DNA序列(单峰)，杂合子小鼠为杂合性的Krt9基因c.434delAinsGGCT突变(双峰)，而杂合子小鼠为纯合性的Krt9基因c.434delAinsGGCT突变(单峰)。

图2左图(a1和a2)Krt9-wt野生型小鼠出生后～3周左右两只前爪足垫区皮肤的表现，右图(b1和b2)Krt9-indel突变型小鼠出生后～3周左右两只前爪足垫区皮肤的表现。箭头所示为突变型小鼠前爪足垫区皮肤的蜕皮现象。

图3左图Krt9-wt野生型小鼠出生后～11周左右前爪(a1和a2)和后爪(a3和a4)足垫区皮肤表现，右图Krt9-indel突变型小鼠出生后～11周左右前爪(b1和b2)和后爪(b3和b4)足垫区皮肤的表现。框内所示为突变型小鼠前爪和后爪足垫区的黑色增厚角化斑。

图4Krt9-indel突变型小鼠连续4周的前爪足垫区角化斑观察结果，这类角化斑出现增生-蜕皮-增生症状循环，周期约为3周。在每个循环的第3周，突变小鼠足垫区的角化斑出现蜕皮脱落现象。周而复始。

图5左图(a1和a2)Krt9-wt野生型小鼠出生～11周左右的前爪足垫区皮肤石蜡切片H-E染色结果，右图(b1和b2)Krt9-indel突变型小鼠出生后～11周左右前爪足垫区皮肤石蜡切片H-E染色结果。箭头所示为Krt9-indel突变型小鼠前爪足垫区表皮上基底棘层和颗粒层的角质形成细胞的核周边形成空泡；标尺为100μm。

图6上部3幅照片(a1、a2和a3)为Krt9-indel突变型小鼠出生～11周左右的前爪足垫区皮肤的扫描电镜图，下部3幅照片(b1、b2和b3)为Krt9-wt野生型小鼠出生～11周左右的前爪足垫区皮肤的扫描电镜图。从左到右放大倍数依次为30×、65×和200×。箭头所示为表皮松解性破坏的病理改变。

图7Krt9-indel突变型小鼠足垫区皮肤透射电镜结果。a：在上基底层细胞胞浆中存在明显的空泡样改变和黑色聚集颗粒物形成(箭头)；标尺为2μm。b：空泡样改变放大效果图；标尺为1μm。c：黑色聚集颗粒物放大效果图；标尺为1μm。

图8Krt9-PCR1的PCR合成(a)，连T载体PCR验证(b)，连PL253菌落PCR鉴定(c)，Pst I酶切验证(d：4906、2455、840、178bp)和Sac I酶切验证(e：4488、2302、1589bp)。T(T14)：19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489、925bp；DL(DL2000)：2000、1000、750、500、250、100bp。

图9Krt9-434DelAinsGGCT突变的5’-ARM序列，两端分别带有Kpn I-Pac I和Bgl II-XhoI-EcoR I酶切位点，其中Bgl II/Xho I用做Southern酶切。字体不同处为突变改造位点。

图10Krt9-3ARM经PCR合成(a)后和PL452载体分别进行BamH I和Not I双酶切反应，酶切反应产物进行连接反应，Krt9-3ARM-PL452连接反应产物进行菌落PCR鉴定。挑取阳性克隆进行进一步酶切验证(c)(BamH I和Not I双酶切：5357、537bp；Sac I：8964、3624、1823bp)。pUC57-Krt9-5ARM(d)和Krt9-3ARM-PL452(e)分别进行Kpn I和EcoR I双酶切反应，Krt9-3ARM-5ARM-PL452连接产物进行菌落PCR鉴定(f)。挑取阳性克隆进行进一步酶切验证(g)(Kpn I和EcoR I双酶切：5309、592bp；Sac I：3793、2193bp)。T(T14)：19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489、925bp；DL(DL2000)：2000、1000、750、500、250、100bp。

图11Krt9-PCR1-PCR2-PL253载体电转入EL350PCR反应鉴定(a)。Krt9-突变-loxp-PL253载体PCR反应鉴定(b)(Krt9testF/tR扩增BAC为539bp，扩增突变-loxp-neo-lopx片段插入成功的PL253载体时为2461bp)。挑取阳性克隆进行酶切验证(c)(Bgl II：9304、3611、2092bp；Apal I：103432、1730、1246、746、645、298bp)。T(T14)：19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489、925bp；DL(DL2000)：2000、1000、750、500、250、100bp。

图12Krt9-突变-loxp-PL253载体pop-out后进行PCR鉴定反应(a)(BAC PCR产物：539bp，Pop PCR product：664bp)。(b)挑取阳性克隆进行酶切验证(Sca I：7760、3624、1826bp；XbaI：9740、3021、449bp)。T(T14)：19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489、925bp；DL(DL2000)：2000、1000、750、500、250、100bp。

图13以Krt9-BAC为模板，PCR合成Krt9-PCR1-BstZ17I位点改造DNA片段(a)，Krt9-突变-loxp-PL253载体(BstZ17I处理过)比未处理过的对照的样本跑胶慢(b)，共转后的Krt9-突变-loxp-PL253载体PCR鉴定反应(c)。挑取阳性克隆进行酶切验证(d)(BstZ17I和Spe I双酶切：10637、5658bp)。T(T14)：19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489、925bp；DL(DL2000)：2000、1000、750、500、250、100bp。

图14Krt9-突变-loxp-neo-loxp-PL253打靶载体图谱。黑色箭头所示为knock-in突变所在位置。

图15小鼠干细胞打靶操作流程图。

图16Krt9-突变-loxp-neo-loxp-PL253载体电转小鼠ES细胞后第2天(A)、第3天(B)、第4天(C)、第6天(D)和第8天(E)的干细胞状态。(F)为囊胚注射前的ES细胞状态。

图17ES细胞3’-端阳性克隆筛选电泳图。结果显示阳性克隆为1G、1E、1D、1C、2H、2G、2F、2E、2D、2C、2B、3F、3E、3D、3C、3B、4H、4G、4F、4E、4D、4B、4A、5G、5E、5B、6E、6D、6C、7H、7F、7E、7A、8C、9G、9F、9D、9B、10H、10G、10B、11E、12G、12F。

图18ES细胞5’-端阳性克隆筛选电泳图。对上述ES细胞克隆3’-端阳性克隆进行5’端序列PCR筛选，确定阳性克隆为：1C、2H、2G、2F、2D、2C、2B、3F、3E、3C、3B、4H、4F、4B、4A、5G、5B、6E、6D、6C、7H、7F、7E、7A、8C、9F、9D、9B、10H、10G、10B、12F。

图19中靶ES细胞阳性克隆的DNA测序结果。框内所示为重组进去的GGCT突变碱基。

图20左图为5’-端序列验证结果。阳性ES克隆相对于B6阴性对照多出一条5.8kb的条带。右图为3’端序列验证结果。DNA经Hpa I酶切后，阳性ES克隆相对于B6阴性对照多出一条6.3kb的条带。

图21F1代185号～195号小鼠PCR基因型鉴定结果。其中1号引物扩增条带只有在阳性突变杂合小鼠中存在，条带大小为503bp。而2号引物扩增条带在阳性突变杂合小鼠中表现位2个条带(483和361bp)，而在野生型小鼠中只有1个条带(361bp)。Maker：2K+(trans2K+)，+表示阳性对照，-表示阴性对照。

图22杂合突变型小鼠，纯合突变型小鼠和野生型小鼠分别用1号引物(上图)和2号引物(下图)进行PCR扩增的电泳图。wt：野生型；Hom：纯合突变型；Hez：杂合突变型。

图23阳性杂合小鼠基因型鉴定DNA测序验证。(a)：1号引物扩增产物测序结果，框内所示为重组进去的GGCT突变碱基；(b)2号引物扩增产物测序结果，框内所示为重组进去的GGCT突变碱基；(c)：野生型小鼠的测序结果，框内所示为该位点未发生突变的A碱基。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

小鼠的饲养和繁育：C57BL/6J和C3H/Hej购自Jackson实验室(美国)，饲养在南京大学模式动物研究所的AALAC认证的SPF级的动物房里。所有的小鼠操作均严格按照“Principles oflaboratory animal care”(美国国立卫生院发行号85–23，1985修订版。http://grants1.nih.gov/grants/olaw/references/phspol.htm)和“The care and use of laboratory animals”(美国国家研究理事会，1996)，并得到了南京大学模式动物研究所动物管理委员会的批准和监督。

实施例1含有重组Krt9基因的打靶载体质粒的构建

1.三片段PCR法合成Krt9基因，通过酶切连接的方式克隆入PL253载体

(1)设计3对PCR引物，以Krt9-BAC质粒(购自CHORI研究所)为模板，分步完成Krt9基因的克隆(Krt9-PCR1和Krt9-PCR2，Krt9-PCR3)(表1)。三片段PCR法采用PrimerStar高保真酶，体系如下(50μl)：

反应程序为94℃变性5min，然后进行次循环，每个循环为94℃变性30s，适当的复性温度下退火30s，72℃延伸3min，最后72℃延伸5min。PCR扩增产物走1.5％含溴化乙锭(0.5μg/ml)的琼脂糖凝胶电泳。在紫外灯下，割胶回收目的片段。经胶回收试剂盒抽提目的DNA片段，溶于30μl ddH₂O，分别获得扩增产物Krt9-PCR1，扩增产物Krt9-PCR2和扩增产物Krt9-PCR3。

表1三片段PCR法合成Krt9基因的验证及改造引物序列、退火温度及产物大小

(2)Krt9-PCR1产物加A连T载体，做KCM转化，挑克隆，进行DNA测序。

加A反应体系(25μl)：

PCR反应在PTC-200型热循环仪上进行。程序为72℃ 30min。加A后产物克隆入T载体，连接体系如下(10μl)：上述加A反应产物4μl、pMD18-T载体1μl、Solution I 5μl，16℃反应2h后取出连接产物做KCM转化，具体步骤如下：

1)1×DNA混合物的制备(50μl)：10μl的连接产物，10μl的5×KCM，30μl的ddH₂O混合均匀。

2)取l00μl的感受态细胞置冰上解冻后将细胞均匀悬浮，制成感受态菌液。

3)将步骤2)感受态菌液全部加到1×DNA混合物中，轻轻旋转几次混匀内容物。冰浴20min后，室温放置10min。加入新鲜的400μl无抗生素的LB液体培养基到上述混合物中，37℃摇菌30min。将菌液12000rpm×30s，弃大部分上清，剩余100μl上清用于重悬沉淀。

4)将步骤4)沉淀悬浮液全部转移到含氨苄青霉素的LB平板，涂布均匀。倒置平板于37℃培养箱，过夜。次日做菌落PCR鉴定(引物：M13F/Krt9PCR1tR)，挑选阳性克隆摇菌，第3天菌液进行DNA测序。结果证实了连接转化的成功。

(3)Krt9-PCR1和PL253分别经Not I和Spe I双酶切，连接反应，菌落PCR鉴定及酶切验证，挑选阳性Krt9-PCR1-PL253连接产物，保种。

37℃，反应过夜。酶切产物，过PCR反应纯化试剂盒回收，溶于30μl ddH₂O。

16℃反应5.5h后，取出连接产物做KCM转化。次日，做菌落PCR(引物为：M13F/Krt9PCR1tR)，挑取阳性克隆摇菌，第3天提取质粒做酶切验证(Pst I、Sac I)，酶切体系如下(20μl)：

37℃反应1h。结果如图8所示。挑选阳性Krt9-PCR1-PL253连接产物保种。

(4)Krt9-PCR2和Krt9-PCR1-PL253分别经BstZ17I和Spe I双酶切，连接反应，菌落PCR鉴定(引物：Krt9PCR1tF/Krt9PCR2tR)，挑取阳性克隆摇菌，酶切验证(BstZ17I和Spe I双酶切、Sac I酶切)及DNA测序验证(方法同步骤“(3)”)。挑选阳性Krt9-PCR1-PCR2-PL253连接产物。

(5)Krt9-PCR3和Krt9-PCR1-PCR2-PL253分别经Asc I和Spe I双酶切，连接反应，菌落PCR鉴定(引物：Krt9PCR2tF/Krt9PCR3tR)，挑取阳性克隆摇菌，酶切验证(Asc I和Spe I，SacI)及DNA测序验证(方法同步骤“(3)”)。挑选阳性Krt9-PCR1-PCR2-PCR3-PL253连接产物。

2.合成带Krt9-434DelAinsGGCT突变的5’-ARM(图9)和PCR合成3’-ARM，将其分别克隆入PL452载体的loxP-NEO-loxP片段两端。

(1)将pUC57-krt9CDS载体的434位A突变为GGCT，合成含Krt9-434DelAinsGGCT突变的5’-ARM序列，即Krt9-434DelAinsGGCT-5ARM，两端分别带有Kpn I-Pac I和Bgl II-Xho I-EcoRI酶切位点，其中Bgl II/Xho I用做Southern杂交的酶切反应。

(2)PCR法合成Krt9-3ARM。

设计1对PCR引物(表2)，以Krt9-BAC为模板扩增含Krt9-434delAinsGGCT突变的5’-ARM序列下游的一段DNA片段，分别在两端带上BamH I和Not I酶切位点。PCR反应采用PrimerStar高保真酶，反应体系同“1.(2)”。PCR产物割胶纯化后进行DNA测序。

表2 PCR合成3-ARM片段和验证Krt9-3ARM，5-ARM片段克隆入PL452载体的引物序列、退火温度及产物大小。Hpa I/Stu I用做Southern杂交的酶切反应。

(3)通过酶切连接反应，将Krt9-3ARM，Krt9-434DelAinsGGCT-5ARM片段分别克隆入PL452载体。

1)Krt9-3ARM片段和PL452载体分别进行BamH I和Not I双酶切反应，

37℃，反应过夜。

2)Krt9-3ARM片段经BamH I和Not I双酶切后的产物用PCR产物纯化试剂盒回收，PL452载体双酶切产物跑胶回收。

3)双酶切后的Krt9-3ARM片段和酶切后的PL452载体进行连接，连接反应体系如下(10μl)：

16℃反应5.5h后，取出连接产物做KCM转化(方法同“1.(2)”)。次日，做菌落PCR(引物为：Krt9-3ARM-tF/tR)，挑取阳性克隆摇菌，第3天提质粒做酶切验证(BamH I和Not I双酶切，Sac I)。进行DNA测序验证。挑取阳性Krt9-3ARM-PL452。

4)Krt9-434DelAinsGGCT-5ARM载体和Krt9-3ARM-PL452载体分别进行Kpn I和EcoR I双酶切反应，酶切反应体系同“2.(3)1)”，双酶切产物跑胶回收。双酶切后的Krt9-3ARM-PL452和Krt9-434DelAinsGGC-5ARM进行连接反应，反应体系同“2.(3)3)”。次日，做菌落PCR(引物为：LoxP66/71-tF/tR)，挑取阳性克隆摇菌，第3日提质粒做酶切验证(KpnI和EcoR I双酶切，Sac I)。进行DNA测序验证。挑取阳性Krt9-3ARM-5ARM-PL452质粒。

3.通过同源重组方法将Krt9-434delAinsGGCT突变和loxP-NEO-loxP片段克隆入Krt9-PCR1-PCR2—PCR3-PL253载体。

(1)Krt9-PCR1-PCR2-PCR3-PL253载体电转EL350。具体方法如下：

1)取100μl EL350大肠杆菌菌液到4ml新鲜的LB液体培养基中，37℃摇菌至OD值到0.4～0.6左右。将4ml菌夜倒入15ml离心管中，冰上放置15min。3 500rpm离心6min，弃上清，加入1ml 10％的甘油重悬沉淀(冰上预冷)。再重复两次3 500rpm离心6min和10％甘油重悬沉淀操作。最后一次离心完后，弃去大部分上清，剩余100μl左右的上清液用来重悬沉淀。

2)取10μl Krt9-PCR1-PCR2-PCR3-PL253载体加到“步骤1)”100μl左右的感受态细胞悬液中，混匀后，全部转移到电转杯中。设置电转参数1.75kV、25μF开始电转。将电转完的混合液加到1.5ml含有新鲜的LB液体培养基的离心管中。置于37℃摇床摇菌1h。3 500rpm离心5min，弃大部分上清，剩余100μl左右上清液重悬沉淀，将混合液全部转移到含有氨苄青霉素的LB平板上。倒置于30℃培养箱，培养过夜。挑取单克隆到新鲜的LB液体培养基中，37℃摇床摇菌过夜。次日，抽提质粒进行PCR反应鉴定(引物：Krt9PCR2tF/Krt9PCR3tR，CreF/R)。挑取阳性克隆Krt9-PCR1-PCR2-PCR3-PL253，保种。

(2)复苏含有Krt9-PCR1-PCR2-PCR3-PL253的EL350菌液，做感受态细胞(方法同“1.(2)”)。但在菌液OD值到0.4～0.6左右，增加42℃摇床热激15min这一步骤。

电转入4μl的线性化的Krt9-3ARM-5ARM-PL452片段(Kpn I酶切处理)。涂(终浓度为1‰氨苄青霉素抗性)的LB培养基中，倒置于30℃培养箱，培养过夜，然后进行下述后续鉴定。

(3)Krt9-3ARM-5ARM-PL452重组Krt9-PCR1-PCR2-PCR3-PL253载体，PCR反应鉴定。

在上述LB平板中，挑取单克隆到新鲜的LB液体培养基中，37℃摇床，摇菌过夜。次日，抽提质粒进行PCR反应鉴定(引物：Krt9-KitF/LoxP66/71-tR；Krt9testF/tR)。挑取阳性克隆进行酶切验证(Bgl II，Apal I)(图11)。挑取阳性Krt9-突变-loxp-PL253载体。

4.通过pop-out实验、酶切验证和DNA测序的方法验证载体序列

取100μl EL350做感受态细胞，方法基本同“1.(2)”，除了增加在37℃摇床摇菌至OD值到0.4左右，加入阿拉伯糖至终浓度为1mg/ml这一步骤。电转入Krt9-突变-loxp-PL253载体，涂(AK抗性)的LB培养基中，倒置于30℃培养箱，培养过夜。次日，抽提质粒进行PCR鉴定反应(引物：Krt9testF/tR)。挑取阳性克隆进行酶切验证(Sca I、Xba I)(图12)。终载体进行DNA测序验证，结果表明获得了目的基因。

5.Krt9-突变-loxp-PL253载体的Krt9-PCR1-BstZ17I位点改造

(1)引物序列见表2。PCR反应采用PrimerStar高保真酶，反应体系同“1.(2)”。PCR产物割胶纯化后进行DNA测序。

(2)Krt9-突变-loxp-PL253用BstZ17Ⅰ酶切处理过夜。次日割胶回收。

(3)取100μl EL350做感受态细胞，42℃ 15min热激诱导。将1μl的Krt9-突变-loxp-PL253载体(BstZ17I处理过)和6μl的Krt9-PCR1-BstZ17I改造片段共转入EL350感受态细胞。涂(终浓度为1‰氨苄青霉素抗性)的LB培养基中，倒置于30℃培养箱，培养过夜。

(4)次日，抽提质粒进行PCR反应鉴定(引物：Krt9PCR1-mutF/tR)。挑取阳性克隆进行酶切验证(BstZ17I和Spe I双酶切)(图13)，最终获得含有重组Krt9基因的打靶质粒载体，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

6.打靶质粒载体的制备

用商业化的质粒中/大提试剂盒(德国MN公司)制备打靶载体(图14)，按照试剂盒说明书操作。

实施例2

1.含重组Krt9基因的打靶质粒载体的干细胞打靶

用Not I处理含有重组Krt9基因的打靶质粒，使之线性化，将DNA浓度调整约为1μg/μl。小鼠干细胞打靶操作流程示意图如图15所示。

2.小鼠干细胞饲养层细胞(feeder cells)的制备

1)小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞)的制作与冻存：

①取孕龄12.5d～14.5d的C57BL6J母鼠，断颈处死，75％酒精消毒后，腹腔剪开一小口，小心撕开暴露出腹腔；

②换一套剪刀和镊子，打开腹腔，取出胚胎，放入装有20ml PBS的10cm培养皿中，洗净血液；

③将胚胎用PBS洗1遍，转移至另一个装有20ml PBS的10cm培养皿中；

④另取一套剪刀与镊子将胚囊逐个分开；剪开子宫，取出胚胎，将分离出的胚胎置于另一个装有20ml PBS的10cm培养皿中；

⑤换一套剪刀与镊子，胚胎去头去尾及内脏，内脏置于1.5ml EP中做基因型检测用；胚胎置于事先滴有0.25％胰蛋白酶的皿盖上，一个胚胎一滴，标记好顺序；

⑥用弯头剪，弯头朝上，将组织块剪碎(约1mm³)。室温放置5分钟；吸取消化好的组织到10cm培养皿中，用枪吹打10下，每个培养皿加ES-M 10ml培养液培养；

⑦第2天换液，去除组织块及死细胞(此时可观察到许多类型的细胞，但当再继代培养后，除了成纤维细胞外其他均不能存活)；

⑧37℃，5％CO₂培养2～3天，等MEF细胞长满。可-80℃冻存。

2)Feeder Cells的制作：

第1天，传代MEFs：

①负压吸去培养基，加入4ml D-Hanks，吸去D-Hanks，加入1.5ml胰酶/EDTA。

②37℃培养箱中，消化3min。

③加入4ml 10％FBS-DMEM中止胰酶的作用。

④转移细胞到50ml离心管中，离心1000rpm 3min。负压吸去上清。

⑤用10％FBS-DMEM重悬细胞。铺到2～4个1cm的培养皿上。

第3天，制作feeder cells：

①负压吸去培养基。加入10ml新鲜的10％FBS-DMEM和10μg/ml mitomycin C。

②37℃培养箱中，放置2～3h。同时准备多个10cm培养皿，各加上2ml 0.1％gelatin。

③吸去mitomycin C，加入8ml D-Hanks，吸去D-Hanks，重复3次。

④加入1.5ml胰酶/EDTA，37℃培养箱中消化3min。

⑤加入4ml 10％FBS-DMEM，中止胰酶的作用。转移细胞到50ml离心管中，离心1000rpm3min。负压吸去上清。

⑥用20ml 10％FBS-DMEM重悬细胞。计数。稀释到3.5*105/ml，铺到用0.1％gelatin预处理过的10cm培养皿上(10ml/盘)。一般一个10cm长满的MEFs可以做成3个10cm的feeder cells。37℃培养。一周内使用。

3.小鼠ES细胞打靶，中靶克隆的筛选

第1天，ES Cells复苏：

①提前一天铺制feeder cell。

②从液氮罐取出一管打靶用ES Cells，迅速置于37℃水浴锅中溶化。

③与8ml不含LIF的ES培养基一起转移到14ml离心管中。

④离心1000rpm 5min，负压吸去上清。

⑤用ES培养基重悬细胞，铺到10cm的有feeder cells的培养皿上(10ml液体)。

12小时后，ES Cells换液。

⑥负压吸去培养基。加入10ml新鲜的ES培养基。

第3天，ES Cells传代：

①负压吸去培养基，加入4ml PBS，吸去PBS，加入1.5ml胰酶/EDTA。

②37℃ 5min。吹打至单个细胞状态。加入4ml不含LIF的ES培养基，中止胰酶的作用。

③转移细胞到50ml离心管中，1000rpm离心5min。负压吸去上清。

④用2ml ES培养基重悬细胞，计数。按4～5×10⁶铺到10cm预铺feeder cells的培养皿上，用于第2天电转。

第4天，ES Cells电转：

①要电转的ES细胞3h左右前换新鲜的ES培养基。

②负压吸去培养基。加入4ml PBS，吸去PBS。加入1.5ml胰酶/EDTA，37℃ 5min。吹打至单个细胞状态。加入4ml不含LIF的ES培养基，中止胰酶的作用。

③转移细胞到50ml离心管中，离心1000rpm 5min。负压吸去上清。

④用Ca²⁺/Mg²⁺free PBS 20ml重悬，计数。1000rpm离心5min，负压吸去上清。再用Ca²⁺/Mg²⁺free PBS重悬至细胞浓度为1×10⁷cells/ml的单细胞状态。

⑤取0.8ml的细胞悬液，加到0.4cm宽度的电转杯中，加入30μg线性化的质粒，吹打5～6次，混匀。室温放置5min。

⑥指数波采用240V/500μF，方波用250v、10pulses、1ms/pulses，间隔1s，电转。室温静置5min。

⑦与20ml ES培养基混匀，铺到2个10cm的有feeder cells的培养皿上，10ml/盘。

第5天，ES Cells电转后换液：

负压吸去培养基。每盘加入10ml含200μg/ml遗传霉素(G418)(525μl/400ml Medium)的新鲜ES培养基。

第6天，加负筛选药物：

①在原来含G418的培养液中再按10μl/400ml Medium加入负筛选药物丙氧鸟苷(GANC)，移液管混合均匀后，给细胞换液。以后几天均用含两种药物的培养液换液，筛选。

②每天换液，电转后8～10d可挑克隆，每盘有100多个克隆筛选效果较好。

小鼠ES电转后的状态如图16所示。

4.小鼠ES细胞克隆的挑选、扩增和冻存

第1天，挑选克隆：

①提前一天准备一块96孔板feeder cells。

②给铺有feeder cells的U型96孔板换上100μl的ES培养基和200μg/ml G418；在每个U型96孔板中每孔各加入10μl PBS。

③负压吸去培养基。加入10ml不含有Ca²⁺/Mg²⁺的PBS，负压吸去。再加入10ml含有Ca²⁺/Mg²⁺的PBS。

④将培养皿置于倒置显微镜下，玻璃吸管移近到要挑选的克隆，用吸管口在克隆周围切割一圈使克隆和周围的feeder cells分离。吸取克隆，转移到步骤①含有10μl PBS的96孔板中。

⑤重复步骤③，直到挑取48个克隆。用排枪每孔加入30μl胰酶/EDTA，37℃8分钟，每孔加80μl ES培养基中和，吹打至单个细胞状态。转移到已换液的铺有feeder cells的U型96孔板中。将挑过克隆的10cm培养皿ES cells换上ES培养基，放回培养箱，换一盘继续挑。

⑥重复步骤③和④，直到挑取96个克隆或更多。

⑦12h后给细胞换上200μl新鲜的ES培养基和200μg/ml+G418。

第3天，ES Cells换液：

负压吸去培养基。加入200μl新鲜的ES培养基和200μg/ml G418。

第4天，ES Cells传代：

①提前一天准备2块96孔板feeder cells。

②待ES细胞长至80％融合度时，以1：3传代，其中一盘用于提DNA。负压吸去培养基，加入200μl D-Hanks，吸去D-Hanks，加入30μl胰酶/EDTA。

③37℃培养箱放置5min。吹打至单个细胞状态。

④加入120μl ES培养基和200μg/ml G418中止胰酶的作用。混匀。

⑤在3个96孔板中(其中两盘铺有feeder cells，一盘只包被0.1％gelatin)预先换成150μlES培养基和200μg/ml G418。

⑥12h后给细胞换上200μl新鲜的ES培养基和200μg/ml G418。

第6天，ES Cells冻存(2盘冻存)：

①负压吸去培养基，加入200μl D-PBS，吸去D-PBS，加入30μl胰酶/EDTA。37℃ 5min。加入80μl ES培养基中止胰酶作用。吹打至单个细胞状态。

②加入100μl用冰预冷的冻存液，混匀。

③加上50μl用冰预冷的过滤灭菌的矿物油。用Parafilm封住四周。放进一个预冷的泡沫盒中(内置棉花)，置于-80℃冰箱中。可保存2～3个月。

第8天，ES Cells提纯DNA(1盘包被0.1％gelatin)。

5.96孔板ES细胞的DNA纯化

在0.1％gelatin包被的96孔板上的ES Cells生长3～5d后，可用于抽提基因组DNA。

①负压吸去培养基，加入D-PBS(200μl/孔)洗两次，每孔加入50μl lysis buffer。55℃湿盒静置48h。

②每孔缓慢滴加100μl NaCl-乙醇。150μl 5M NaCl加至10ml预冷的100％乙醇，会有沉淀产生，属于正常现象，混匀后加入即可，现用现配。

③室温放置5h，不要晃动。可以看到像丝网状的核酸沉淀下来。

④小心地倒扣96孔板到吸水纸上，核酸将留在孔底。小心地每孔滴加150μl 70％乙醇，45度倾斜倒掉洗液，再轻倒扣在吸水纸上吸净剩余的乙醇，共洗3次。倒扣96孔板，室温干燥1～2h。

⑤加入1×TE(30～60μl/孔)，用封口膜将96孔板密封好，防止液体蒸发，静置24h后，即可用于PCR检测。

6.96孔板ES细胞PCR鉴定

根据小鼠中靶后插入Krt9-突变-loxp序列，设计3’-端和5’-端筛选PCR引物，引物序列和反应条件如下表所示(表3)。PCR反应产物走0.8％琼脂糖凝胶电泳，检测阳性克隆(图17、图18)。

表3 ES细胞中靶阳性克隆筛选PCR引物、扩增大小及反应条件

7.中靶ES细胞阳性克隆测序的验证

选取6个较好的克隆1C、3F、4H、4F、9D和9B的PCR产物进行DNA测序验证。

插入突变测序结果如图19所示。

8.中靶ES细胞阳性克隆Southern blot验证

(1)PCR阳性ES细胞的扩增与冻存

扩增：

①Feeder cell铺制24孔板，一个克隆预铺3孔。

②PCR阳性的克隆确认后，从-80℃的冰箱中将96孔板中取出，酒精喷表面。擦干酒精，放置到培养箱中，约30min。期间改变孔板放置的位置，以便其快速融化，待冰晶全部化掉后。将细胞全部吸取到24孔板中，每个克隆对应一孔。

③换液观察2～3d，若24孔生长良好，融合度达50％以上的可1：2传代到24孔板；

④换液观察1～2d，若24孔板中细胞融合度达到70％～80％以上可1：1传代到6孔板。

⑤换液观察1～2d，若6孔板生长融合度达到70％～80％以上则可用1孔传代到铺有明胶的10cm培养皿，1孔传到100mm培养皿(用于保种)。

冻存保种：

换液观察1～2d，生长融合度达到70％～80％以上准备冻存。

①保种的ES cell要在冻存的细胞提前2h换上新鲜的ES培养基。

②负压吸去培养基，加入4ml DPBS，洗涤一次。

③加入1.5ml/10cm培养皿0.25％胰酶37℃消化5分钟。3ml/10cm培养皿ES培养基终止反应。

④用移液枪小心吹打至单个细胞，收集离心；1000rpm离心5min，负压吸去上清；加入预冷的ES-冻存液重悬，然后将细胞悬液转移至冻存管中，1ml/冻存管，共5管，冻存管4℃放置10min；

⑤将冻存管先放入泡沫盒中，并立即放入-80℃冰箱过夜；次日将冻存管转移至液氮中保存。

(2)用于Southern blot的ES细胞的DNA纯化

第1天：

①待培养皿中细胞长满后，用3ml冰冷的PBS洗一次。

②在培养皿内直接加入2ml细胞裂解液，加入后液体非常粘稠，用细胞刮将其刮下，然后将细胞悬液转移至离心管中。将离心管放入55℃水浴，48h。

第2天：

①将消化好的细胞上下颠倒轻柔混匀；加入等体积的酚/氯仿(V/V)抽提一次，10000g 10min离心收集水相。

②等体积的氯仿抽提1～2次，10 000g 10min离心收集水相。

③2倍体积的无水乙醇，静置10min；10 000g离心10min。

④加入3ml 70％乙醇，10 000g离心5min；小心弃掉上清，管底透明沉淀部分即为DNA。室温晾干(>30min)。

⑤加入200μl TE，可放入37℃助溶。短期4℃保存，长期-20℃保存。

得到的6个ES细胞候选阳性克隆DNA进行Southern blot鉴定。DNA分别用经5’-端Bgl II酶切鉴定和3’-端Hpa I酶切鉴定，以证实为阳性克隆(图20)。

9.阳性ES细胞电转pCMV-CRE

选取2个阳性ES细胞克隆进行复苏、传代。电转pCMV-CRE，去除阳性ES细胞基因组上带有的neo-loxp元件，电转方法同打靶载体。电转后24h后加入GANC筛选药物。挑取克隆，提取DNA，进行PCR鉴定。PCR引物同上述打靶质粒的pop-out实验。同理，PCR筛选到的体外去除neo-loxp元件的阳性克隆PCR条带为664bp(包含SEQ ID NO:1序列)，而未成功改造的野生型ES细胞为539bp。筛选得到的去除neo-loxp元件的阳性ES细胞克隆用于最终的小鼠囊胚注射。

10.阳性ES细胞克隆的复苏、传代和囊胚注射前处理。

选取2个阳性ES细胞克隆进行复苏、传代。

第1天：

①囊胚注射时间确定后，在注射前5天，复苏要注射的细胞到6cm培养皿，复苏时先加5ml不含LIF的ES培养基于10ml管中，备用。

②液氮中取细胞于37℃水浴锅中快速融化。

③将冻存液全部吸出到10ml离心管中，1000rpm/5min离心。

④3.5ml重悬细胞，加入一个6cm培养皿中。每天换液。

第3天：

ES细胞传代，根据细胞的密度传代，融合度达到80％以上的可以按1：6～1：8传代，若密度较低，则适当降低传代比例，第2天换液。

第5天：

传代，同上，控制好传代密度。若对细胞密度把握不准备，可做2盘细胞，按不同比例接种，最后按优选择。

第6天：

①取状态良好的6cm培养皿ES细胞，负压吸取上清。

②加入2ml DPBS，洗一次，负压去上清。

③加750μl胰酶消化5min。加入1.5ml ES培养基终止反应，并用移液枪小心吹打成单个悬浮细胞，转移至10ml离心管，1 000rpm离心5min。

④负压吸去上清，加入3ml ES培养基，重悬细胞，将细胞悬液加入到事先铺有0.1％gelatin的6cm培养皿上，贴附1h左右。

⑤45～60min后，细胞上清吸掉，用2ml ES培养基由下至上将贴附于培养皿上的ES细胞冲下来，转移至10ml离心管中，1 000rpm离心5min。

⑥负压吸去上清，加入200μl ES培养基重悬即可。同时准备工作液普通ES培养基和含1MHEPES的(500μl ES培养基加10μl 1M HEPES)ES培养基。囊胚注射前应记录ES细胞的状态。

11.阳性ES细胞囊胚注射

囊胚注射在南京大学模式动物研究所完成。

12.囊胚期胚胎的准备

(1)选用3周龄的C57BL/6J雌鼠为注射用供体，超促排卵。给供体雌鼠注射孕马血清促性腺激素(PMSG)，46～48h后注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)，即与雄鼠合笼。第2天早上检栓。见栓的当天上午为0.5d，我们在第6天上午取见栓2.5d即8细胞期的胚胎。

假孕鼠的制备。第5天下午取8周以上(体重>20g)的雌鼠与结扎公鼠合笼交配，第6天上午检栓方法同供体鼠。见栓的雌鼠为假孕鼠。见栓的当天上午为0.5d。

获取8细胞期的胚胎。第6天上午断颈处死见栓2.5d供体鼠。用70％酒精将其背部打湿，在背部靠尾端用镊子拎起皮肤，剪刀剪出一个横切口，用镊子夹住切口处的皮肤向头侧剥开，暴露背侧腰部的肌肉。用小剪刀在此处开一小口，用镊子夹住体内卵巢上的脂肪堆，将其拖出体外，再用镊子夹住子宫，取输卵管及子宫中上部放入预先准备好的M2(或D-PBS)液滴中。

可用吸有M2(或D-PBS)的注射器配钝口的4#针头，插入输卵管伞部冲洗整个输卵管及子宫中上部。收集胚胎并将卵子洗涤干净，洗去血细胞及残渣等。并将洗好的胚胎转移到覆盖有矿物油的M16液滴中，再放入5％CO₂、37℃培养箱中培养2天至囊胚期。

13.囊胚显微注射

注射用液为含0.02mol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、未添加白细胞抑制因子(LIF)的ES细胞培养液，移入前述的阳性克隆ES细胞。用持卵针固定囊胚，每个囊胚注射15个左右的ES细胞。注射完毕后，将囊胚移入2.5d的假孕母鼠子宫内，每侧子宫约放入6～8个囊胚。待产。

14.Krt9基因突变小鼠的获得与基因型鉴定

移植后第17.5天，嵌合鼠出生。挑选嵌合率>50％的雄性嵌合体小鼠与野生型C57BL/6J雌性小鼠交配，检栓后19～21d，F1代小鼠出生。得到的阳性杂合突变F1代小鼠在7～8周左右分别与野生型C57BL/6J或杂合突变型F1代小鼠配繁殖笼，得到杂合突变型和纯合突变型F2代小鼠。新生小鼠出生7d左右，进行剪指编号。取得的F1代小鼠尾巴组织，用于基因型分析的材料。

15.鼠尾DNA的纯化

第1天：

剪取0.5cm小鼠尾巴放入1.5EP管后加入500μl的鼠尾消化裂解液，5μl 10mg/ml蛋白酶K。将加好buffer的管子放入55℃的水浴中消化过夜。

第2天：

①用力将消化好的组织摇匀，每管加入500μl酚/氯仿(1：1，事先配好，4℃保存)混匀，离心：12 000rpm/10min。

②转移400μl上清至新的标记好的1.5EP管内。加入800μl无水乙醇(2倍于上清的体积)，上下颠倒混匀。12 000rpm/5min离心。弃去上清。

③加入800μl 70％乙醇，12 000rpm/5min离心。弃去上清。自然晾干(>30min)。

④加入200μl TE，可放入37℃助溶。短期4℃保存，长期-20℃保存。

16.鼠尾基因型的PCR鉴定

由于突变基因敲入阳性小鼠基因组上除了携带有目的基因突变外，还带有1段去除neo-loxp元件后残留的外源序列，大小为122bp。我们设计了2对引物对目标序列进行RCR鉴定(表4)。PCR产物走1.5％琼脂糖凝胶电泳。阳性小鼠PCR产物进行DNA测序。测序引物同PCR扩增引物(图21～23)。

表4小鼠基因型鉴定PCR引物

结果：mutF/R3引物扩增条带只在Krt9-indel小鼠中存在，条带大小为503bp。而gptF/tR引物扩增条带在野生型小鼠中表现为1个条带(361bp)，而在杂合性Krt9-indel小鼠中表现为2个条带(483bp和361bp)，而在纯合性Krt9-indel小鼠中表现为1个条带(483bp)。Krt9-indel小鼠和野生型小鼠PCR产物再进一步进行DNA测序验证。杂合性Krt9-indel小鼠的DNA测序结果与野生型小鼠相比较在Krt9基因的第1外显子第434位核苷酸出现碱基A的缺失和碱基GGCT的插入，峰型为移码杂峰，而在纯合性Krt9-indel小鼠中峰型为纯合突变峰(图1)。表明建模成功。

17.Krt9knock-in突变小鼠的表型分析

(1)表型观察：

在小鼠出生后21d分笼后，开始观察突变小鼠前爪及后爪足垫区皮肤，并做好观察记录和总结。结果：Krt9-indel小鼠足垫区皮肤存在明显的角质层增厚，上基底层主要是颗粒层和棘层细胞过度增生，并在细胞核周围出现空泡样改变(图2～图4)。

(2)组织学观察：

组织石蜡包埋、石蜡切片、石蜡切片H-E染色、石蜡切片的免疫组化分析均按常规方法进行(参见赵荧，唐军民主编：《形态学实验技术》，北京大学医学出版社，2008)(图5)。

用免疫组化技术分析小鼠足垫区皮肤的分子表达水平，从而分析小鼠胚足垫区皮肤发育异常的机理。取同窝10周龄的突变型和野生型小鼠，进行石蜡包埋切片后采用中杉金标SP法进行免疫组化分析。检测细胞增殖和分化相关的标记蛋白Ki-67和P63；表皮皮肤中后期和终末分化层蛋白丝聚合蛋白和外披蛋白；以及表皮细胞常见的标志蛋白K1、K2、K5、K10和K16在Krt9-indel突变足垫区皮肤以及野生型足垫区皮肤中的表达水平以及表达区域。

(3)突变小鼠的蛋白质检测：

蛋白提取、蛋白杂交(Western blot)均按常规方法进行(参见纳吉等主编，孙青原、陈大元主译：《小鼠胚胎操作实验手册》，化学工业出版社，2006)。

(4)突变小鼠皮肤的电镜观察

取同窝10周龄的突变型和野生型小鼠，CO₂处死后，剥离小鼠前爪及后爪皮肤，贴于滤纸上。放入2.5％的戊二醛磷酸缓冲液中，4℃固定过夜。分别用于扫描电镜和透射电镜的观察分析(参见赵荧，唐军民主编：《形态学实验技术》，北京大学医学出版社，2008)。

扫描电镜结果显示Krt9-indel小鼠的足垫区皮肤存在表皮松解性破坏的病理改变(图6)。进一步的皮肤组织透射电镜分析显示，在Krt9-indel小鼠足垫区皮肤中，颗粒层和棘层细胞存在明显的空泡样改变以及类似异常角蛋白堆积形成的黑色颗粒物(图7)。

总结：

(1)本发明所获得的Krt9-indel小鼠携带人KRT9首例报道的小插缺突变：c.500delAinsGGCT同源的突变类型。

(2)本发明所获得的Krt9-indel小鼠表型出现的时间及部位高度模拟表皮松解性掌跖角化症患者的发病时间及临床表现。

(3)本发明所获得的Krt9-indel小鼠在组织病理学上与表皮松解性掌跖角化症患者相一致。

本发明所获得的Krt9-indel小鼠通过蛋白质印迹实验、免疫组化分析等技术的验证，可进一步广泛用于后续的人表皮松解性掌跖角化症的致病病因、病理机制研究，以及对表皮松解性掌跖角化症治疗药物的筛选和基因治疗试验等。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。