腰果主要过敏原Anao3的表位谱分析、重组表达及鉴定

摘要

目的：
　　血清特异性IgE是诊断食物过敏的重要指标，已发展至分子诊断水平。抗原表位是抗原与抗体结合的基本单位，通过抗原表位解析，实现特异性IgE的精准检测。本研究以Ana o3作为研究对象，利用冷休克表达系统获得Ana o3重组抗原；同时，解析Ana o3抗原表位，并制备关键抗原表位串联重组蛋白，提高特异性IgE精准检测水平。
　　方法：
　　1.腰果Ana o3的重组表达：提取腰果总RNA，逆转录至cDNA，设计特异性引物，通过巣式PCR技术克隆腰果Ana o3基因，将其插入pCold-SUMO vector，鉴定并测序；重组质粒测序正确后，转化BL21（DE3）感受态细胞，低温15℃诱导表达。摸索诱导表达条件，以便获取可溶性好、表达量高的Ana o3重组蛋白，镍柱纯化。利用腰果过敏血清作为识别抗体，通过Western blot鉴定免疫活性。
　　2.关键抗原表位的获取：使用三种预测线性抗原表位的软件（DNAsTAR, ABCpred, Bepipred Liner Epitope Prediction）筛选抗原表位。查阅最新关于Ana o3抗原表位研究的文献，并与软件预测结果对比，最终筛选出12条肽段并人工合成。采用斑点印迹技术，以29例腰果Ana o3过敏患者血清sIgE作为一抗，筛选出反应率高的线性表位作为关键抗原表位。
　　3.关键抗原表位串联重组体的构建及表达：获取关键抗原表位的碱基序列，中间插入柔性肽Linker碱基序列串联，5’端和3’端分别加入StuⅠ和BamHⅠ碱基序列，人工合成抗原表位串联体基因。接着，将该基因与 pCold-SUMO质粒进行重组质粒构建，并测序成功。将该重组质粒转入BL21 DE(3)感受态细胞进行重组表达，摸索最优诱导表达条件，镍柱纯化目的蛋白，并进行免疫学活性鉴定。
　　结果：
　　1.从腰果中成功克隆出了Ana o3基因，并将该基因与pCold-SUMO质粒连接送去测序。将测序结果进行比对分析，发现克隆获取的腰果Ana o3基因序列为417 bp，与GenBank上Ana o3基因CDS序列基本一致，而所编码的138个氨基酸则完全相同；SDS-PAGE结果显示，重组Ana o3分子量为27 kDa左右，大小与理论预测值基本一致； Western blot结果显示，重组Ana o3与腰果过敏患者血清具有良好的反应性。
　　2.查阅Ana o3表位的文献，选取12段有反应的肽段作为候选表位。斑点印迹结果显示，12条候选表位肽段与阳性血清呈现不同程度的反应，而11号肽段几乎无反应。统计各候选表位肽段的反应频率，发现1、2、3、6、10号肽段与Ana o3过敏血清的反应频率几乎均在80%以上，因此将1、2、3、6、10号抗原表位作为关键抗原表位。
　　3.考虑到1、2、3肽段依次有12个氨基酸相互重叠，因此可将其视为同一表位。SDS-PAGE结果显示，抗原表位串联重组蛋白分子量为22 kDa，与理论预测大小相符。Western blot结果显示，抗原表位串联重组蛋白能和Ana o3过敏血清sIgE呈现良好的反应性。
　　结论：
　　1.基因克隆并于冷休克原核表达系统获得的Ana o3重组蛋白，表达量高且免疫活性强，证实了该重组Ana o3作为已知抗原用于腰果过敏sIgE检测的有效性。
　　2.查阅文献及生物信息学预测获得的12个候选抗原表位，除了11号以外，其余均为腰果Ana o3的抗原表位，预测结果较准确。
　　3.利用冷休克原核表达系统获得的关键抗原表位串联重组蛋白，具有良好的免疫活性，有可能用作腰果Ana o3血清sIgE检测的优质原料。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、腰果过敏原Ana o 3的重组表达及鉴定

1.1材料与方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、Ana o 3表位解析及抗原表位串联体的表达与鉴定

2.1材料与方法

2.2结果

2.3 讨论

2.4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录1

附录2

综述:树坚果类过敏sIgE 分子诊断的研究进展

致谢

个人简历