融合His Tag重组蛋白的基因克隆、表达及亲和纯化

摘要

本文利用PCR技术体外扩增了大肠杆菌DH5α染色体DNA中的苹果酸脱氢酶的编码基因、质粒pEGFP-C1中的增强型绿色荧光蛋白的目标基因以及牛胰腺全DNA组中的核糖核酸酶A的DNA，并通过BamHⅠ与HindⅢ酶切位点将其与质粒载体pET28a连接，构建出pET28a的重组质粒(pET28a-MDH，pET28a-EGFP和pET28a-RNase A)。将重组质粒转入E.coli BL21(DE3)中，分别得到可以启动T7 promoter表达目标蛋白质(MDH和EGFP)的基因工程菌(aMN3和aEN5)。通过对表达菌培养时间、最佳诱导时机等条件的优化，得到表达菌aMN3的最佳诱导条件：菌体37℃培养4h后加入1mmol/L IPTG，37℃诱导9h；表达菌aEN5最佳诱导条件：菌体37℃培养4h后加入1mmol/L IPTG，37℃诱导3h。对表达产物的分析发现，高效表达的目标蛋白产物(MDH和EGFP)在菌体内主要以包涵体形式存在，但也有部分可溶蛋白表达。经SDS-PAGE凝胶电泳胶密度面积扫描分析得到MDH占全菌蛋白的63.0％，EGFP占全菌蛋白的49.7％，包涵体蛋白的产量分别为153.3 mg/(L培养液)和140.3mg/(L培养液)。 由于表达产物带有6个His Tag，因此利用固定化金属亲和色谱(Chelating SepharoseTM Fast Flow)对表达产物(MDH和EGFP)进行了亲和分离和复性的前期探索性实验。结果表明，固定化金属亲和色谱能够较好的吸附可溶性表达蛋白质和经脲变性的包涵体蛋白质，并可被洗脱缓冲液有效洗脱，得到了较好的分离纯化效果。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 文献综述

1.1基因工程重组蛋白在大肠杆菌中的表达

1.1.1目标基因的获得

1.1.2表达载体选择

1.1.3表达产物的形式

1.1.4包涵体的形成

1.2包涵体蛋白质复性

1.2.1目前常用的体外复性方法

1.2.2固定化金属亲和色谱对蛋白质的分离纯化及复性研究

1.3重组蛋白质简介及选择意义

1.3.1苹果酸脱氢酶

1.3.2增强型绿色荧光蛋白

1.3.3核糖核酸酶A

1.3.3选择重组蛋白质意义

1.4本文主要研究意义及内容

第二章 重组质粒的构建

2.1实验材料

2.1.1菌种和载体

2.1.2工具酶及分子量参照物

2.1.3主要化学试剂

2.1.4主要仪器

2.1.5 引物合成

2.2实验方法

2.2.1 PCR扩增目的基因

2.2.2重组质粒的构建

2.2.3将连接产物转入大肠杆菌及阳性茵落的筛选

2.3结果与讨论

2.3.1 pET28a-MDH重组质粒构建

2.3.2pET28a-EGFP重组质粒构建

2.3.3 pET28a-RNase A重组质粒构建

2.4本章小结

第三章 重组蛋白质的表达及色谱纯化初探

3.1实验材料和设备

3.1.1设备

3.1.2试剂

3.2实验方法

3.2.1外源蛋白在大肠杆菌中的诱导表达

3.2.2 SDS-丙烯酰胺凝胶电泳检测表达产物

3.2.3蛋白质含量的测定

3.2.4固定化金属亲和色谱的蛋白纯化

3.2.5苹果酸脱氢酶活性检测方法

3.2.6荧光测定

3.3结果与讨论

3.3.1苹果酸脱氢酶的表达及纯化

3.3.2增强型绿色荧光蛋白的表达及纯化

3.4本章小结

第四章 结论与展望

4.1 结论

4.2展望

附录

参考文献

攻读硕士期间发表(含在审)论文

致谢