重组黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶在甲醇酵母中表达的改善和基于此的新型农药残留快速检测传感器的改进

摘要

基于酶抑制法原理的农药残留快速检测方法在我国应用最为广泛,但有两点缺陷严重限制了其发展和进一步应用:首先,关键酶乙酰胆碱酯酶的灵敏度不能满足越来越严格的检测要求;其次,采用的光学分析手段易受色素等物质干扰,测试范围小。本文在已有基础上,通过酵母密码子优化等,利用重叠PCR方法改造了黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶DmAChE cDNA序列,在此基础上构建了以AOX启动子的酵母表达载体pPIC9K/DmAChE,在通过电击转化和MM平板快速筛选,进而获得了一株高表达R-DmAChE菌株,其摇瓶培养条件下该重组酶可被分泌到培养基中,性达718 U/mL,相比我们已经报道的未优化密码子时获得转化菌株的表达水平提高了3.4倍。在此基础上,我们将获得的高灵敏度重组乙酰胆碱酯酶用于电化学生物传感器的研制,并在其中利用碳纳米管来提高传感器的性能。采用通过碳纳米管介导电聚合普鲁士蓝作为电子传递媒介,可降低产生信号所需的氧化电压至200 mV;酶的固定采用传统可靠的戊二醛共价偶联法。碳纳米管凭借其巨大的比表面积不仅增加了普鲁士蓝的聚合量,还将信号电流值提高了40％,并将信号平衡时间缩短了300%;此外,凭借碳管创造的特殊微环境,酶传感器的热稳定性得到了提高,对一些农药检测灵敏度也显著提高,如对克百威的检测灵敏度提高了至少10倍。在4种加标饮料种探测出0.5μg/L敌敌畏和5μg/L克百威,说明该传感器能够抵抗糖、咖啡因、酒精、维生素和蛋白质的干扰。因此,本文中获得高表达量、高灵敏度的重组果蝇乙酰胆碱酯酶可为我国农药残留检测提供优质、廉价的酶原材料;同时研制出的以碳纳米管介导的新型电化学传感器具有克服干扰杂质对测定影响的能力,显著提高检测灵敏度等优点,有广泛应用于实际农药残留快速检测的潜力。

目录

摘要

ABSTRACT

第一章 前言

1.1 我国农药生产使用现状

1.2 农药污染带来的负面影响

1.3 农药残留检测技术

1.4 研究的意义

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.2.1 R-DmAChE 的表达

2.2.2 DmAChE 生物传感器的研制和应用

第三章 实验结果与分析

3.1 R-DmAChE 的表达

3.1.1 DmAChE cDNA 的改造

3.1.2 DmAChE 甲醇酵母表达载体pPIC9K/DmAChE 的构建

3.1.3 高活性甲醇酵母重组子的筛选

3.1.4 DmAChE 的诱导表达与分离

3.2 DmAChE 生物传感器的研制和应用

3.2.1 普鲁士蓝的电聚合

3.2.2 氧化电压的确定

3.2.3 表观米氏常数(Km)app 的测定

3.2.4 信号稳定性和热稳定性

3.2.5 pH 值的影响

3.2.6 抑制时间的确定

3.2.7 标准抑制物的测定

3.2.8 加标实际样品的测定

第四章 结论

参考文献

附录Ⅰ本研究技术路线图

附录Ⅱ缩略词表

附录Ⅲ重叠PCR 所用引物

附录Ⅳ传感器技术原理图与制作流程

附录Ⅴ简明抑制物测试流程

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