大麻素CB1受体在帕金森病运动并发症发病机制中作用的实验研究

摘要

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是好发于中老年人的一种运动障碍性疾病，主要的病理生化改变是选择性中脑黑质致密部（substantia nigra compact,SNc）多巴胺能神经元变性缺失，导致下游的纹状体（caudate putamen，CPU）多巴胺（dopamine,DA）含量显著性降低，临床上主要表现为运动迟缓、肌强直、静止性震颤及姿势步态异常。目前PD仍以药物治疗为主，如主流的左旋多巴（levodopa,L-dopa）替代治疗，而长期使用该药会出现左旋多巴诱导异动症（levodopa-induced dyskinesia,LID）等远期并发症，包括症状波动（motor fluctuation）和运动障碍（dyskinesia）等，目前机制不清，尚无好的处理办法。 国内外研究人员针对PD及其运动并发症的发病机制进行了大量的研究工作，也取得了一些进展。随PD病情不断发展以及左旋多巴用药，残存的多巴胺能神经元产生多巴胺的能力丧失，对外源性多巴胺药物的缓冲能力降低，使得纹状体内多巴胺水平不能维持在生理状态，对纹状体中型多棘神经元（medium spiny neurons,MSNs）表面分布的多巴胺受体形成异常的波动性刺激。外源性用药对多巴胺受体的波动性刺激可能引起MSNs信号转导通路的变化,进而影响与之相关的其他受体的状态及突触传递效率。 多巴胺受体和谷氨酸受体共同表达于纹状体MSNs胞膜表面，而大麻素CB1受体（cannabinoid receptor 1,CB1）则位于皮质纹状体投射的谷氨酸能轴突末梢以及小清蛋白（parvalbumin,PV）阳性的γ-氨基丁酸（GABA）能中间神经元轴突末梢，和MSNs形成突触联系。大麻素CB1系统包括了CB1受体和内源性大麻素（endocannabinoid，eCB），对突触之间的信号传递具有重要调节作用。突触前神经递质释放能够激活突触后神经元合成eCB，逆行穿过突触间隙作用于突触前膜CB1受体，激活CB1受体可抑制突触前Ca2+内流，最终反馈性抑制突触前神经递质释放。 近年研究表明，PD纹状体长期失去多巴胺能支配，以及后续的长期多巴胺替代治疗波动性刺激确实引起了大麻素CB1系统的一些改变。因此，对大麻素CB1系统的特性进行研究将是本课题的基石。此外，目前迫切需要寻找和研发新型的抗PD药物，以弥补已有药物的不足。国外的实验研究发现，大麻素CB1系统对谷氨酸、GABA、多巴胺等多种重要神经递质发挥作用有调节功能。CB1受体激动剂可引起动物运动抑制，甚至出现僵硬症（catalepsy）。并且Ferrer等研究发现CB1受体激动剂具有减轻左旋多巴诱导的严重口舌部异常不自主运动的功能。但激活CB1受体是如何减轻运动并发症的神经生化机制，目前尚不清楚。本研究拟采用左旋多巴长期治疗诱导运动并发症的PD大鼠模型，试探讨LID的发生机制，观察使用CB1受体激动剂对LID潜在的防治作用。 本课题共分为三个部分： 第一部分：左旋多巴诱发PD运动并发症大鼠模型的建立和评价引言。 通过6-羟基多巴（6-OHDA）立体定向注射至SD大鼠右侧前脑内侧束（medial forebrain bundle,MFB）建立单侧PD大鼠模型，然后左旋多巴（L-dopa）腹腔注射治疗（50 mg/kg 加12.5mg/kg苄丝肼,每天2次）3周，观察异常不自主运动（abnormal involuntary movements,AIM）及旋转行为。经左旋多巴治疗长期治疗，PD大鼠出现了AIM，包括刻板动作和对侧旋转行为。随着左旋多巴用药时间延长，PD大鼠AIM呈现逐渐加重的趋势，同时还伴随着单位时间剂峰旋转圈数增加、旋转反应时间缩短、关期频率递增等，与人类LID特征十分相似。 上述研究表明，本文成功建立了左旋多巴诱发PD运动并发症大鼠模型，为进一步研究其形成机制奠定了物质基础。 第二部分：大麻素CB1受体在PD及其运动并发症大鼠基底节的表达研究。 采用免疫组化（immunohistochemistry,IHC）染色的方法，观察大麻素CB1受体在假手术对照组大鼠、6-OHDA单侧毁损PD大鼠以及长期使用左旋多巴形成LID大鼠基底节的纹状体、苍白球（globus pallidus,GP）以及黑质网状部（substantia nigra reticular，SNr）表达情况。Western Blot的方法，观察假手术对照组大鼠、PD大鼠以及LID大鼠纹状体内CB1受体的表达量变化。实验结果发现，6-OHDA单侧毁损PD大鼠损伤侧纹状体和GP部位的CB1受体表达明显增多；SNr内的CB1受体则明显减少；长期左旋多巴治疗产生LID的大鼠损伤侧和未损侧纹状体内CB1受体与假手术对照组比较均有增加，并以未损侧增加为主，但损伤侧较PD组有所降低；GP内的CB1受体数量较对照组仍然增加；损伤侧SNr CB1受体表达也显著上调。 上述研究提示，6-OHDA损伤SNc多巴胺能神经元可引起基底节内CB1系统信号传导改变，而长期左旋多巴治疗则使CB1系统的改变更为复杂。大麻素CB1系统发生的改变可能是一种对多巴胺系统信号传导改变的一种内源性代偿，可能与PD及LID运动功能异常的产生有关。 第三部分：CB1受体激动剂WIN55212-2改善PD运动并发症的实验研究。 通过6-OHDA立体定向注射至大鼠右侧MFB建立经典的啮齿类PD动物模型，对成功的PD大鼠模型进行两套实验：第一套实验中PD大鼠接受每日两次左旋多巴（50 mg/kg 加12.5 mg/kg苄丝肼,每天2次）腹腔注射，持续21天。在第22天左旋多巴注射前15min，先接受CB1受体特异性激动剂WIN55212-2（1mg/kg）腹腔注射；第二套实验中PD大鼠每日两次分别接受WIN55212-2+左旋多巴/苄丝肼腹腔注射，共持续21天，药物剂量同上。评估用药后大鼠的旋转反应时间、剂峰旋转圈数变化和关期发生率；采用Western Blot的方法检测纹状体MSNs信号传导通路下游重要的信号蛋白DARPP-32（Thr75）、ERK（Thr202/Tyr204）磷酸化情况。 结果显示，短期应用CB1受体激动剂WIN55212-2对LID作用并不明显。长期联合应用WIN55212-2和左旋多巴，减轻了单独长期使用左旋多巴所至的PD大鼠旋转反应时间缩短、剂峰旋转圈数增加的趋势，并使关期发生频率明显减少；CB1受体阻断剂AIM251与WIN55212-2联合应用则消除了WIN55212-2的减轻LID效应，提示所观察到的WIN55212-2的效应是通过CB1受体起作用的。PD大鼠纹状体内的DARPP-32（Thr75）磷酸化与假手术相比未见明显变化，而左旋多巴使之降低，WIN55212-2与左旋多巴合用，DARPP-32（Thr75）降低更为显著；ERK（Thr202/Tyr204）磷酸化在PD纹状体则减少，长期左旋多巴治疗使ERK（Thr202/Tyr204）磷酸化明显增加，联用CB1受体激动剂和左旋多巴并未使ERK（Thr202/Tyr204）磷酸化恢复正常，仍然高于对照组。 上述研究表明，WIN55212-2是通过CB1受体起作用的，激动CB1受体可能对于PD左旋多巴诱导的运动并发症预防有益。