大豆黄烷酮-3-羟化酶基因(f3h)RNA干扰型载体的构建及功能验证

摘要

类黄酮是植物生长过程中生成的一类次生代谢产物，包括异黄酮、黄酮、查耳酮、花青素等具有生物活性的物质。类黄酮代谢途径的研究对提高食品的功能性成分和植物的防御反应具有重要的作用。本研究采用RNAi 技术原理构建大豆黄烷酮-3-羟化酶基因（f3h）RNA 干扰型植物表达载体，用发根农杆菌转化大豆子叶外植体，干扰类黄酮代谢途径中黄烷酮-3-羟化酶基因，定量PCR 检测f3h基因表达水平，用HPLC 来分析f3h基因干扰后类黄酮物质含量的变化情况。得到主要结果如下： 1）根据NCBI数据库中的大豆黄烷酮-3-羟化酶基因（f3h）的cDNA序列（GeneBank ：AF198451），选取其中的303bp的片段来构建干扰载体，其位置在起始密码子下游的695-997bp 之间。 2）本研究构建的f3h基因RNAi 表达载体pHANNIBAL-F3h-RNAi以载体pHANNIBAL为基本骨架，表达载体功能区由CaMV35S启动子引导，正义片段和反义片段之间由PDK 内含子隔开，终止子是章鱼碱合成酶（OCS）的终止序列。 3）本研究构建的f3h基因RNAi 植物表达载体P1304+-F3h-RNAi 以载体pCAMBIA1304+PBI121为基本骨架，含有载体pHANNIBAL-F3h-RNAi 上f3h基因RNAi 功能区所有结构，并含有一个gus基因表达盒。 4）将f3h基因RNAi 植物表达载体P1304+-F3h-RNAi、载体pCAMBIA1304+PBI121 通过发根农杆菌ATCC15834 介导，转化大豆子叶，获得转化毛状根。 5）定量PCR 功能验证结果表明，f3h基因RNAi 植物表达载体转化生成的毛状根中，f3h基因的表达受到显著抑制，表达量与对照相比降低90％以上。 6）HPLC 分析结果显示，f3h基因RNAi 植物表达载体转化生成的毛状根中，黄豆甙元、黄酮的含量与对照相比明显提高。