BMSCs旁分泌促进c-kit心脏干细胞抗凋亡和分化的研究

摘要

背景与目的：近年来，骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs)、造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSCs）、内皮前体细胞（endothelial pro-genitor cells，EPCs）和骨髓源性单核细胞（BM-derived mononuclear cells，BM-MNCs）等多种细胞被用于细胞移植治疗急性心肌梗死，以实现心肌组织的修复。研究发现，外源性干细胞通过旁分泌作用分泌多种细胞因子，促进心脏的修复和再生。同时，外源性干细胞旁分泌细胞因子介导内源性的再生途径可能参与激活心脏原位干细胞，此外，心室的重塑、收缩功能和代谢可能都会受到旁分泌的影响。我们选择BMSCs作为外源性干细胞，建立体外心肌氧自由基损伤模型，观察BMSCs对于c-kit+心脏干细胞（cardiac stem cells，CSCs）抗凋亡和分化的作用。 方法：取1-3天乳鼠心脏组织进行植块培养，磁珠分选CD45-/c-kit+的CSCs，分化培养基进行培养，免疫荧光鉴定其特异性细胞表面标记物为c-kit。用H2O2诱导氧自由基损伤凋亡，MTT法绘制细胞生长曲线，Western blot检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的比值。用Transwell小室建立BMSCs和CSCs共培养模型，RT-PCR检测共培养后，心肌特异性转录因子Nkx2.5和GATA-4和心肌钙蛋白Ｔ（cTNT）的表达。Western blot检测分化前后细胞核内增殖抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、细胞周期蛋白依赖性激酶2（cyclin-depengdent kinase 2，CDK2）和p27表达的改变。PCR和Western blot分析BMSCs对p27蛋白上游smad2磷酸化的影响，以及对TGF-β受体Ⅲ型（TGF-βＲⅢ）表达的影响。 结果:（1）植块培养和磁珠分选收集到c-kit+CSCs能够分化为表达心肌特异性转录因子（Nkx2.5和GATA-4）和cTnT的类心肌细胞；（2）在H2O2诱导CSCs凋亡过程中，BMSCs能够提高细胞的存活率，下调Bax蛋白的表达，达到抗凋亡的效果；（3）BMSCs通过增加TGF-βＲⅢ的表达，提高磷酸化smad2的比例，减少p27的泛素化水解，使CDK2受到抑制，最终导致c-kit+CSCs离开细胞周期循环进入分化阶段。 结论：在c-kit+CSCs分化过程中，BMSCs能够上调细胞内TGF-βＲⅢ的表达，放大smad2通路信号，p27对G1/S期CDK2的抑制作用加强，促进分化进程。