供体NKT细胞输注促进小鼠皮肤移植耐受及其机理的研究

摘要

高效非特异性免疫抑制剂的迅速发展和临床的广泛应用，使同种器官移植取得了长足的进步，急性排斥率明显降低，器官短期存活率显著提高。但是数十年来，由于慢性排斥和免疫抑制剂的毒副作用，使得器官移植的长期存活率无明显改善。因此，诱导特异性移植耐受，预防急慢性排斥反应，减少药物的毒副作用<'[1]>，避免长期服用免疫抑制剂就成为解决移植器官长期存活的关键问题。既往研究表明，维持对同种异型抗原免疫耐受的重要机制之一是通过产生负调节性T细胞<'[2]>而实现的。NKT细胞(natural killer T cell)是一种新型的淋巴细胞，与T细胞和NK细胞不同，其同时表达T细胞表面受体和NK细胞表面标志，发育受CD1分子限制。近年来的研究发现，NKT细胞是调节免疫反应的重要细胞，在表型、抗原识别及免疫功能方面有其自身的特殊性，特别是近年来的研究认为，NKT细胞在器官移植免疫耐受的产生和维持等方面具有重要的作用。 本实验利用小鼠同种皮肤移植模型，研究受体小鼠体内预先注射NKT细胞对移植物存活时间、混合淋巴细胞反应、迟发型超敏反应、某些细胞因子及体内外过继转移实验的影响，同时与经典的抗排斥药物环孢霉素(CsA)对比进行研究，目的在于试图阐明NKT细胞免疫抑制及诱导耐受作用的机理，为研究利用NKT细胞诱导移植耐受提供实验依据。文中建立了小鼠同种皮肤移植模型，尾静脉输注供体NKT细胞、移植后腹腔注射CsA及NKT细胞与CsA联合应用，术后逐日观察移植皮肤存活情况及小鼠一般状况。移植后14d，应用<'3>H-TdR掺入法，研究NKT细胞和CsA对混合淋巴细胞反应的影响，对耐受小鼠做迟发型超敏反应，确定小鼠的耐受状态。通过体内外过继转移实验、脾组织中细胞因子IL-10mRNA、IL-4mRNA、IL-2mRNA的表达情况，进一步探讨耐受形成的机制。 1．与对照组相比，移植前尾静脉输注NKT细胞、移植后腹腔注射CsA．及两者的联合应用可以明显延长移植皮片的存活期。 2．移植前尾静脉输注NKT细胞可以明显抑制移植后14d的小鼠混合淋巴细胞反应。 3．移植前尾静脉输注NKT细胞可以明显抑制超敏反应的发生。 4．移植前尾静脉输注NKT细胞形成的移植耐受可被过继转移。 5．移植前尾静脉输注NKT细胞可上调Th2型细胞因子IL-10、IL-4的表达，下调Th1型细胞因子IL-2的表达。

目录

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符号说明

前 言

实验材料与方法

(一)实验材料

1.分离小鼠肝脏中淋巴细胞的实验材料

2.扩增单个核细胞(KNC)中KNT细胞的实验材料

3.建立同种皮肤移植模型的小鼠和相关实验材料

4.混合淋巴细胞培养所用实验材料

5.组织总RNA提取的实验材料

6.转录反应的实验材料

7.PCR反应的实验材料

8.使用引物设计软件(Gene Tool)进行引物设计，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成以下引物

9.DNA电泳实验材料

10.实验用药

(二)实验方法

1.分离小鼠肝脏中淋巴细胞的实验方法

2.单个核细胞(MNC)中NKT细胞的扩增

3.小鼠同种皮肤移植模型的制备

4.混合淋巴细胞培养

5.迟发型超敏反应

6.TRIzol一步法提取组织总RNA

7.RT-PCR反应

8.PCR产物琼脂糖凝胶电泳

9.体内过继转移实验，参照文献

10.体外过继转移实验，参照文献

11.实验动物分组

12.统计学分析

实验结果

1.耐受小鼠的同种皮肤移植物存活时间明显延长

2.混合淋巴细胞反应的实验结果

3.迟发型超敏反应结果

4.细胞因子检测结果

5.过继转移实验结果

讨论

小结

参考文献

论文综述：NKT细胞与移植免疫

致谢

附录 攻读研究生期间发表的学术论文目录