汉坦病毒GM04-38株N-联糖基化位点在细胞融合中的作用

摘要

目的： N-联寡糖链可以在很多方面影响蛋白的功能。已有报道显示某些病毒融合蛋白的寡糖链缺失可使病毒的细胞融合功能缺陷或丢失。已有报道显示汉坦病毒的G2糖蛋白可能是其融合蛋白。鉴于汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白G1和G2也是通过N-联糖基化作用来修饰的,本研究拟通过实验对汉坦病毒N-联糖基化位点在细胞融合中的作用进行初步探讨。从而为阐明HV的细胞融合机制、研制有效的汉坦病毒新型疫苗和治疗制剂奠定基础。
　　 方法根据GM04-38株M片段cDNA基因序列应用Primer5软件设计引物,同源重组PCR法构建5个单个氨基酸突变的N-联糖基化位点的克隆载体。PCR扩增N-联糖基化位点突变体的编码区基因,双酶切后与经过同样双酶切的表达载体pCAGGS/MCS连接,转化大肠杆菌DH5α,氨苄青霉素筛选N-联糖基化位点单个氨基酸突变体的表达载体。经双酶切和测序证实。将真核表达质粒G1Bg1,GmG2及4个G1突变体,1个G2突变体提取后分别共转染Vero E6细胞,间接免疫荧光检测蛋白表达情况,免疫印迹实验确定糖蛋白表达情况,并经酸性MEM处理、Giemsa染色后观察细胞融合现象的发生。
　　 结果1.构建了5个N-联糖基化位点单个氨基酸突变的克隆载体N134A、N235A、N347A、N399A、N928A双酶切鉴定载体长度约为2.7kb；N134A、N235A、N347A、N399A突变体长度约为2.1kb；N928A突变体长度约为1.6kb,并经测序证实。
　　 2.构建了5个N-联糖基化位点单个氨基酸突变的表达载体G1Bg1-N134A、GlBg1-N235A、G1Bg1-N347A、G1Bg1-N399A、GmG2-N928A、双酶切鉴定,载体长度为4.7kb；N134A、N235A、N347A、N399A突变体目的片段长度约为2.1kb；N928A突变体目的片段长度约为1.6kb,并经测序证实。
　　 3.间接免疫荧光实验显示野毒株G1Bg1与GmG2共转染组、G1Bg1及各N-联糖基化位点突变体转染组均有亮绿色荧光信号产生,呈胞浆分布。
　　 4.免疫印迹实验显示野毒株G1Bg1与GmG2共转染组出现两条带,分别为68KDa和55KDa,N134A突变体转染组不显示G1条带,其余各突变体转染组均显示G1、G2两条带。
　　 5.共转染N134A或N928A突变体组未出现细胞融合现象,而其他突变体及野毒株GlBg1与GmG2共转染后则出现融合现象。
　　 结论 G1上的134位点可能与蛋白正确折叠有密切关系,134位点突变极可能导致蛋白的错误折叠,进而无法转运出内质网。G2上的928位点对细胞融合有重要作用,提示汉坦病毒融合肽很有可能位于G2上。

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