雷帕霉素电纺丝缓释药膜抑制大鼠自体移植静脉狭窄的实验研究

摘要

研究背景:
　　 冠状动脉旁路移植术(CoronaryArterialBypassGrafting，CABG)是冠状动脉粥样硬化性心脏病的重要临床治疗措施，2012年国际权威杂志NEJM的冠心病观察性研究证实患者接受CABG治疗可获得比PCI治疗更长的生存期[1]。临床上作为CABG移植材料的主要有乳内动脉、大隐静脉和桡动脉，由于乳内动脉和桡动脉取材的限制性，大隐静脉一直作为CABG的重要取材血管。但移植后大隐静脉桥狭窄发生率较高，成为心血管外科亟需解决的临床难题[2]。目前有关大隐静脉桥狭窄防治的实验研究集中在血管内皮细胞及中层平滑肌细胞的干预治疗上，而对于大隐静脉主要管壁结构——血管外膜的研究却极少。近年来，血管外膜在移植血管狭窄中的作用开始受到重视，有研究提示血管外膜对于血管结构和功能有着直接或间接的重要调控作用[3]。外膜成纤维细胞是血管外膜的主要细胞类型，越来越多的研究证实血管外膜成纤维细胞在移植血管病变过程中并非是无辜的旁观者，而是积极的参与者[4]。最近我们参与的课题组发现静脉移植于动脉后因血管张力发生改变首先启动移植静脉外膜的成纤维细胞，分泌细胞外基质(ECM)、各种生长因子、细胞因子，如TGF-β1、MCP-1、MMPs等，诱导外膜成纤维细胞增殖并转化为成肌纤维细胞(myofibroblast，MF)[5]，向中膜层及内膜迁移，参与新内膜的形成。而目前国内外尚无以外膜成纤维细胞为靶点，防治自体移植静脉狭窄的研究。
　　 雷帕霉素(Rapamycin)，又称西罗莫司，是一种亲脂性三烯含氮的大环内酯抗生素类免疫抑制剂，具有很好的抗排斥作用，被广泛应用于器官移植[6，7]。由于它具有极好的抑制血管再狭窄的作用，近年来受到心血管研究领域的极大关注，被广泛应用于药物支架涂层来预防血管成形术后再狭窄。同时，随着对血管外膜研究的深入，雷帕霉素对血管外膜的作用也开始受到越来越多的关注[8]。临床上大隐静脉桥的狭窄一般发生于移植后几周到几个月的时间内，对移植静脉长期的干预治疗才能有效地改善桥血管的狭窄[9]。因此我们建立大鼠自体静脉移植模型，在移植静脉局部包裹携带雷帕霉素的新型电纺丝缓释药膜，观察研究雷帕霉素缓释系统能否通过血管外周释放有效抑制自体移植静脉新内膜形成，从而改善移植静脉的中远期通畅率。
　　 药物缓释载体是防治移植静脉的关键部分。目前用于制作药物缓释载体的材料多为人工合成的聚合物，如聚乙醇酸(PGA)及其共聚物PLGA，聚乳酸(PLA)等[10]。在实验过程中发现此类聚合物存在不少缺点，如亲水性差，细胞粘附力弱，产生酸性降解产物从而引起无菌性炎症等等。而可降解聚碳酸亚丙酯(PPC)是不释放酸性产物的新型聚合物，其最终降解产物是二氧化碳和水[11]，最大程度地避免了药膜接触所引起的局部无菌炎症。并且PPC的亲水性和细胞粘附力明显优于PGA和PLA。电纺丝是一种制备高分子纳米/微米纤维的新兴方法，受到较多关注，由于电纺丝的直径为微米/纳米级[12]，大大增加了药物释放面积，其微观结构多孔，方便能量和物质的跨膜交换。电纺丝可通过调整结晶性、共混比例、共聚组成及微观结构等来调节降解速度，从而有效控制药物缓释[13]。我们通过建立雷帕霉素电纺丝缓释药膜，以探讨其在防治自体移植静脉狭窄的可行性和中远期效果。
　　 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)作为雷帕霉素的主要作用靶点，是细胞生长和增殖的重要调节因子。mTOR信号及其表达产物的研究越来越受到人们的关注，大量研究显示mTOR信号途径的调控与细胞的生长与增殖密切相关[14]。mTOR在TOR1和TOR2被发现后即被鉴定并克隆，其氨基酸序列高度保守，属于磷酯酰肌醇激酶相关蛋白家族(PI3K)家族的成员，这一家族中的成员与细胞的基本功能有关，如:细胞增殖、DNA损伤修复、细胞周期以及端粒长度维护等[15]。FAK和MMPs(尤其是MMP2和MMP9)与血管外膜成纤维细胞增殖、迁移、粘附功能密切相关，PI3K/Akt/mTOR细胞传导通路在成纤维细胞中的研究甚少[16]。研究雷帕霉素在此通路中的作用及能否调控FAK及MMPs的表达从而有效抑制成纤维细胞的增殖迁移，对移植静脉外膜炎症及桥血管狭窄的研究有重要意义。
　　 目的:
　　 建立大鼠颈静脉—腹主动脉自体血管移植模型，观察自体移植静脉狭窄病变，分析移植静脉狭窄与外膜成纤维细胞、外膜炎症的关联。利用新兴电纺丝技术制作雷帕霉素缓释药膜，将缓释药膜用于大鼠移植静脉外周，观察药膜对移植静脉狭窄及外膜炎症的抑制作用。以自体移植静脉的外膜成纤维细胞为研究靶点，从细胞水平分析外膜成纤维细胞增殖迁移对移植静脉狭窄的影响，并从分子水平探讨雷帕霉素通过外膜成纤维细胞的PI3K/Akt/mTOR细胞传导通路对FAK及MMPs表达的影响，从而防治移植静脉的狭窄。为临床冠状动脉旁路移植术中，在大隐静脉外周局部用药抑制术后静脉桥狭窄提供新的思路。
　　 方法:
　　 1、利用“Cuff”套管法制作Wistar大鼠颈静脉—腹主动脉自体血管移植模型，分别于术后1周、4周、8周用血管超声检测桥血管是否通畅，并测定桥血管搏动指数(PI)及阻力指数(RI)，处死动物后移植静脉行HE染色，计算血管面积指数，血管外膜面积百分数及新生内膜面积百分比，并行免疫组化染色，分析移植静脉狭窄与外膜成纤维细胞、外膜炎症的关联。
　　 2、利用新兴电纺丝技术，将PPC与雷帕霉素混匀后制成缓释药膜，共制三种药膜（低浓度药膜、高浓度药膜、空白对照药膜），用扫描电镜观察雷帕霉素缓释药膜的表面形态特征，将药膜完全溶解后用紫外分光光度法测定雷帕霉素的载药量和包封率。精确称取雷帕霉素缓释药膜，放入PBS中，置于37℃恒温水浴摇床中，在0.5d、1d、2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d、16d、18d、20d、22d、24d、26d、28d后，检测残余药品中药物含量，得到雷帕霉素药物释放曲线。
　　 3、重新建立大鼠自体血管移植模型，术中将雷帕霉素缓释药膜均匀紧密地缠绕于静脉桥外周，分为对照组、空白药膜组、低浓度药物药膜组、高浓度药物药膜组。于术后4周处死，处死后行HE染色，计算血管面积指数，新生内膜面积百分比及血管外膜面积百分比，观察雷帕霉素药膜对移植静脉狭窄及外膜炎症的抑制作用。并从细胞水平分析外膜成纤维细胞增殖迁移对移植静脉狭窄的影响。
　　 4、取幼年大鼠腹主动脉外膜组织，剪碎后用培养瓶贴块法培养原代血管外膜成纤维细胞。传代成功后行细胞鉴定，MTT法检测雷帕霉素药膜对细胞活性的影响。细胞流式分析检测各组药膜对成纤维细胞周期的影响。用Transwell小室检测空白药膜及低、高浓度药膜对细胞迁移能力的影响。WesternBlot检测药膜对外膜成纤维细胞FAK、pFAK、mTOR、pmTOR、MMP2、MMP9、ERK1/2、PCNA等表达含量的影响。分析雷帕霉素通过外膜成纤维细胞的PI3K/Akt/mTOR细胞传导通路对FAK及MMPs表达的影响。
　　 结果:
　　 1、静脉移植手术成功率90％，术后1周移植静脉通畅率100％，术后4周通畅率88.9％，术后8周通畅率77.8％。血管超声检查显示术后4周开始桥血管管壁明显增厚，术后4周及术后8周桥血管搏动指数PI及阻力指数RI均明显大于静脉对照组。大鼠处死后静脉桥HE染色显示，术后4周及术后8周静脉桥内膜增生明显。其管壁面积指数AI及外膜面积百分比均明显增高于静脉对照组。说明术后4周及8周桥血管阻力增加，血管外膜增厚伴新内膜形成，造成移植静脉的狭窄。免疫组化显示静脉桥形成的新内膜有大量vimentin和α-SMA表达阳性的细胞，说明在静脉移植术后，静脉外膜最先出现病理变化，外膜成纤维细胞增殖，转型为成肌纤维细胞，迁移至静脉内膜参与内膜增生，造成移植静脉狭窄的病理过程。
　　 2、雷帕霉素/PPC缓释药膜的制作条件较为严格，必须是纺丝距离为15-20cm，纺丝电压为10-15kV才能顺利流畅地进行电纺丝制作。通过扫描电镜观察，电纺丝纤维光滑均匀，交织成立体网格状，纤维平均直径为3μm。利用紫外分光光度法测得雷帕霉素在低浓度药膜和高浓度药膜中载药量分别为4.5％、10.3％，包封率分别为95.1％、90.6％。利用HPLC法测得雷帕霉素缓释药膜的释放曲线，5％雷帕霉素缓释药膜在前8天释放较快，释放41％，到28天释放91.5％。10％雷帕霉素缓释药膜在前6天释放较快，释放40％，到28天释放93％。是一种成功的雷帕霉素缓释系统。
　　 3、将雷帕霉素缓释药膜用于动物模型，术后4周缓释药膜明显抑制了静脉桥新内膜的形成，内膜上成纤维细胞明显减少，移植静脉狭窄明显减轻，同时静脉外膜厚度亦明显变薄。免疫组化显示药膜明显降低血管外膜FAK、PCNA、mTOR、MMP2及MMP9的阳性表达百分比。
　　 4、培养瓶组织贴块法行细胞培养时，于第7-9天开始组织块周围长出细胞，第10-12天细胞融合至80％左右，原代传代，细胞生长旺盛，2-4天即可再次传代。细胞免疫荧光检测vimentin为阳性表达，而α-SMA和desmin为阴性表达，可以鉴定为血管外膜成纤维细胞。扫描电镜观察发现在药膜上生长3天的VAF仍呈伸展状态，有的细胞进入电纺丝网格内，但在雷帕霉素药膜上的细胞伸展性明显差于空白PPC膜上的细胞。MTT检测提示PPC材料对成纤维细胞活性无影响，雷帕霉素药膜可以明显抑制成纤维细胞的活性。细胞流式分析显示雷帕霉素药膜明显抑制VAF由G1期进入S合成期。Transwell迁移分析显示低浓度及高浓度药膜均对成纤维细胞的迁移产生明显抑制作用。WesternBlot分析示低浓度药膜和高浓度药膜均能明显抑制成纤维细胞mTOR、pmTOR、ERK1/2、pERK1/2的表达，说明雷帕霉素参与到成纤维细胞PI3K/Akt/mTOR细胞通路中，药膜同时抑制成纤维细胞FAK、pFAK、MMP2、MMP9的表达，减弱了细胞的粘附迁移功能。
　　 结论:
　　 1、利用“Cuff”套管法可成功制作大鼠颈静脉-腹主动脉自体血管移植模型。自体静脉移植术后最先出现移植静脉外膜的增厚及外膜成纤维细胞的增殖和向内膜迁移，成纤维细胞参与静脉桥新内膜的形成，从而造成移植静脉狭窄。
　　 2、雷帕霉素缓释药膜可稳定释放药物，能持续释放28天甚或更长时间，对自体移植静脉狭窄及外膜炎症有明显抑制作用。
　　 3、通过组织贴块法成功培养血管外膜成纤维细胞，雷帕霉素缓释药膜可明显抑制成纤维细胞的增殖和迁移，从而抑制移植静脉的狭窄。
　　 4、雷帕霉素参与外膜成纤维细胞PI3K/Akt/mTOR细胞通路，且有效抑制成纤维细胞FAK及MMPs的表达，从而抑制移植静脉的狭窄。但是确切机制尚需进一步研究证实。

目录

声明

摘要

主要实验技术路线图

主要英文缩略词表

第一部分 大鼠自体静脉移植模型的建立、移植血管狭窄及外膜变化的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 利用电纺丝技术制作雷帕霉素缓释药膜

前言

材料与方法

结果

讨论

第三部分 雷帕霉素／PPC电纺丝缓释药膜抑制自体移植静脉狭窄的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

第四部分 P13K／Akt／mTOR细胞传导通路在雷帕霉素／PPC电纺丝缓释药膜抑制血管外膜成纤维细胞迁移的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

附图表

附图

参考文献

课题创新点及局限性

致谢

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