表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂治疗晚期非小细胞肺癌疗效的预测及监测因素研究

摘要

目的:
　　 肺癌是对人类健康最严重的威胁之一，目前肺癌临床特点及发病机制的研究取得了一些进展，但疗效仍然不能令人满意。非小细胞肺癌(NSCLC)的长期存活率较低，晚期非小细胞肺癌患者传统化疗疗效处于平台期，进一步增加剂量与疗程不能提高疗效及生存期，反而会加重患者的不良反应。近年来，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)的问世给NSCLC患者的治疗提供了新的途径。目前，在NSCLC的二线治疗中，EGFR-TKI代表药物厄洛替尼已被证明能显著延长患者的总生存期，其中EGFR基因突变的患者疗效较好。EGFR-TKI的疗效对于EGFR基因野生型的部分患者甚至差于传统化疗。2011年美国国立综合癌症网络(NCCN)非小细胞肺癌治疗指南指出，已知EGFR基因突变时，可以选择EGFR-TKI作为晚期非小细胞肺癌的一线治疗。目前医学界已经广泛接受EGFR基因突变是EGFR-TKI药物疗效的关键预测因素，在晚期非小细胞肺癌制定治疗计划前检测EGFR基因突变是非常必要的。
　　 然而另外一些证据表明EGFR-TKI药物并非对所有有EGFR基因突变的NSCLC患者有效，EGFR基因突变的晚期NSCLC患者应用EGFR-TKI药物治疗的缓解率约为58-82.9％。如何更准确预测厄洛替尼的疗效尤为重要，错误的选择会导致延误病情，使患者失去最佳治疗时机并蒙受经济损失。所以如何进一步提高对EGFR-TKI药物疗效的预测水平成为目前急需解决的问题，也是本研究拟解决的第一个问题。是否可以在检测EGFR基因的基础上联合检测其他指标，从而更加准确的预测EGFR-TKI药物的疗效？
　　 第二个问题是目前EGFR基因的检测需要一定体积的新鲜肿瘤组织标本，临床工作中常常会因为各种原因无法获取足够的组织块，从而影响了EGFR基因检测。这种情况下如何预测EGFR-TKI的疗效是临床工作中的难题。
　　 本研究拟解决的第三个问题是如何进一步提高对厄洛替尼疗效的监测效率。在应用EGFR-TKI治疗非小细胞肺癌过程中，临床医师需要尽早、准确地判断药物的疗效，决定是否继续治疗还是改变治疗方式。目前国际通用的实体瘤疗效评价标准(RECIST)主要是应用CT、MRI等影像学检查，虽然已经初步引入肿瘤标志物来评价疗效，但是尚未有规范的参考标准。目前的研究显示，EGFR-TKI类药物首先是引起肿瘤细胞增殖代谢方面的变化，使得恶性肿瘤细胞增生减缓或停止，肿瘤体积变化往往发生较晚，单纯应用影像学检查往往不能及时了解疗效。本研究联合应用影像学及血清肿瘤标志物的变化来评价药物的疗效，力图将这种联合检测标准化，从而更早期、更准确判断EGFR-TKI的疗效，指导临床医师及时的修订治疗方案。
　　 我们入组并分析了56例应用厄洛替尼治疗的晚期NSCLC患者的资料，应用PCR技术检测EGFR基因情况，应用免疫组化方法检测标本ALDH1A1、CD133、CD34的表达情况。同时联合应用PET-CT、血清肿瘤标志物（癌胚抗原、神经源烯纯化酶、细胞角蛋白19片段）等手段来预测及监测厄洛替尼的疗效。以期通过这些手段解决以上三个问题。
　　 方法:
　　 一、临床资料
　　 入组标准:1:年龄为18至85周岁之间，不伴有任何严重的全身性疾病（如心力衰竭、严重肝、肾疾病等）;2:经病理学证实为非小细胞肺癌，且无手术指征的ⅢB～Ⅳ期患者;3:东部协作肿瘤组(EasternCooperationOncologyGroup，ECOG)体力状态评分为0-3分;4:对于一线治疗患者必须为新诊断首次治疗，厄洛替尼治疗之前未进行手术、放化疗等治疗;对于二、三线接受治疗患者，厄洛替尼开始之前接受过至少1种化疗方案;5:患者血常规、生化检查基本正常;6:签署知情同意书，患者依从性好，配合随访;7:预期寿命至少为8周。
　　 共入选56例经厄洛替尼治疗的晚期NSCLC患者，其中属Ⅰ线治疗者14例、Ⅱ线治疗27例、Ⅲ线治疗者15例;腺癌39例、鳞癌12例、大细胞癌5例;男性26例、女性30例;年龄29～81岁，平均年龄59.9岁。ECOG评分0分3例、1分21例、2分25例、3分7例;无吸烟史31例、有吸烟史25例;ⅢB期19例、Ⅳ期37例。服药方法:厄洛替尼150mg，每日1次，持续用药直至肿瘤进展或出现不可耐受的不良反应，所有入组患者在实验结束时均临床死亡。治疗开始前2周内行PET-CT、血清肿瘤标志物检查、EGFR基因检测及ALDHlAl、CD133、CD34的表达情况，在患者治疗完成1个月时进行疗效评价，以后每1～2个月进行肿瘤相关影像学及肿瘤标志物检查。对于评价为CR或PR或SD的患者，1月后给予重新评价疗效，以防止出现CR率过高。
　　 二、实验设备和试剂
　　 PET-CT显像设备是美国GEDiscoveryLS，显像剂为18F-FDG。血清肿瘤标志物的检测采用全自动电化学发光法，使用的试剂盒均为德国罗氏诊断有限公司生产，操作过程严格按说明书步骤进行。应用PCR法检测EGFR基因突变情况，仪器为美国应用生物系统公司生产的ABIPrism7500型荧光定量PCR仪，试剂盒是由厦门艾德生物医药科技有限公司生产的人类EGFR基因21种突变荧光PCR检测试剂盒。Olymplus显微图像成像采集仪，兔抗人CD133多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，兔抗人CD34单克隆抗体购自Abcam公司(EP373Yab81289)，兔抗人ALDH1A1单克隆抗体购自Abcam公司(EP1933Yab52492)。
　　 三、统计学方法
　　 采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，所有计量数据分析前均进行正态分布检测。率的比较应用卡方(x2)检验。临床病理因素与药物有效性的关系应用Logistic回归做多因素分析。无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)与临床病理因素的关系应用t检验（属于正态分布数据）和秩和检验（不符合正态分布的数据）进行分析。应用Kaplan-Meier方法进行生存分析，制作生存曲线图。应用Cox回归分析临床病理因素与死亡率及病情进展率的关系。检验P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 一、疗效与临床病理因素的关系
　　 全组56例患者中，完全缓解(CR)病例1例、部分缓解(PR)25例、稳定(SD)17例、病情进展(PD)13例;总的客观缓解率(ORR)为46.4％，疾病控制率(DCR)为76.8％。卡方检验提示在客观缓解率方面，女性高于男性，分别为63.3％和26.9％(P=0.006);腺癌患者高于非腺癌患者，分别为56.4％和23.5％(P=0.023);不吸烟者高于吸烟者，分别为64.5％和24.0％(P=0.003);有皮疹患者高于无皮疹患者，分别为59.5％和21.1％（P=0.006）。在疾病控制率方面，女性高于男性，分别为90.0％和61.5％(P=0.012);腺癌患者高于非腺癌患者，分别为89.7％和47.1％(P=0.002);不吸烟者高于吸烟者，分别为93.5％和56.0％(P=0.001);有皮疹患者高于无皮疹患者，分别为91.9％和47.4％(P=0.001)。多因素Logistic回归提示:GEFR基因突变是疾病客观缓解的有效预测因素(P=0.028)。
　　 二、症状改善情况
　　 全组56例中，主要的临床不适症状表现为咳嗽、气促、胸闷、胸痛、骨痛、乏力等，经治疗后症状改善者共27例(48.2％)，症状改善的中位时间为25天。其中经治疗后达到CR的患者1例，症状改善率为100％，达到PR的25例患者中18例症状有改善，症状改善率72％，SD患者的症状改善率29.4％，PD患者的症状改善率为7.7％。
　　 三、生存期及影响因素
　　 所有入组的56例患者的中位PFS为7.6个月，OS为16.0个月，PS评分0-1分的患者较2-3分的患者有更长的PFS（分别为9.7月和5.4月，P=0.001）及OS（分别为17.5月和13.1月，P=0.022）。腺癌较非腺癌患者有更长的PFS（分别为8.8月和3.8月，P=0.000）及OS（分别为17.4月和9.5月，P=0.000）。不吸烟患者较吸烟者有更长的PFS（分别为9.2月和4.9月，P=0.001），及OS（分别为17.9月和11.3月，P=0.000）。有皮疹患者较无皮疹者有更长的PFS（分别为8.4月和5.1月，P=0.015）及OS（分别为16.7月和11.6月，P=0.008）。所有被评为客观缓解的患者(CR+PR)较未达客观缓解者有更长的PFS（分别为9.6月和5.2月，P=0.001）及OS（分别为18.4月和12.0月，P=0.000）。所有被评为客观有效的患者(CR+PR+SD)较治疗无效的患者有更长的PFS（分别为9.0月和1.5月，P=0.000）及OS（分别为17.9月和5.3月，P=0.000）。Ⅰ线接受治疗的患者较Ⅱ/Ⅲ线接受治疗的患者有更长的PFS（分别为11.5月和5.8月，P=0.003）及OS（分别为22.0月和12.6.月，P=0.000）。经Cox回归分析显示，患者病情进展的危险因素有治疗时期、PS评分及治疗疗效，患者死亡的危险因素有治疗时期、病理类型及治疗疗效。
　　 四、不良反应
　　 最常见的不良反应为皮疹(37/56)，其次是腹泻(25/56)、皮肤干燥(11/56)、厌食(14/56)、疲乏(13/56)、转氨酶升高(13/56)，未发生不可耐受的不良反应而退出治疗的情况，所有不良反应均为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级，无1例发生间质性肺炎，未发现药物相关性死亡事件。
　　 五、与PET-CT相关的结果
　　 所有患者治疗前PET-CT的中位标准摄取值(SUV)值为4.9。其中，非腺癌患者的SUV值要高于腺癌患者，分别为8.9和5.3(P=0.006)，无皮疹患者的SUV值高于有皮疹患者，分别为8.2和5.3(P=0.009)。SUV值＜5的患者客观缓解率(ORR)高于SUV值≥5的患者，分别为65.5％vs25.9％（P=0.003）。SUV值＜5的患者较SUV值≥5的患者有更优的PFS（分别为8.5和6.0，P=0.047）及OS(分别为17.1和12.7，P=0.018)。
　　 六、与肿瘤标志物相关的结果(标志物单位均为ng/ml)
　　 治疗前三种肿瘤标志物与患者的临床病理因素及疗效的关系:年龄≥60岁的患者的神经元特异性烯醇化酶(NSE)值均数高于60岁以下的患者，分别为12.0和6.0（P=0.002）。腺癌患者的癌胚抗原(CEA)水平高于非腺癌，分别为32.0和11.5（P=0.000）;非腺癌的细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)水平高于腺癌患者，分别为23.0和4.3（P=0.000）;吸烟患者的CEA水平小于不吸烟的患者，分别为16.8和33.0(P=0.003);Ⅰ线治疗的患者的CEA水平高于Ⅱ、Ⅲ线患者，分别为36.4和22.2(P=0.034);PET-CT的SUV值小于5的患者的CEA水平高于≥5的患者，分别为34.4和16.5（P=0.001）;EGFR基因突变阳性的患者的CEA水平高于突变阴性患者，分别为30.2和15.5(P=0.018);EGFR基因突变阳性的患者的CYFRA21-1水平低于阴性患者，分别为4.3和34.0(P=0.000);治疗后出现皮疹的患者的CEA水平高于未出现皮疹的患者，分别为32.3和12.9(P=0.000);治疗后表现为客观缓解(CR+PR)的患者的CEA水平高于未缓解的患者，分别为37.3和15.7（P=0.000）;治疗后表现为客观有效(CR+PR+SD)的患者的CEA水平高于无效的患者分别为30.5和10.1(P=0.000)。其余临床病理因素与三种肿瘤标志物无明显相关性。在评价PFS及OS方面，以所有患者治疗前CEA值的均数25.8为界分组，评价组间PFS及OS的差异，结果显示，CEA水平≥25.8的患者较CEA水平＜25.8的患者获得更佳的PFS（分别为10.2月和5.6月，P=0.001）及OS（分别为19.3月和12.6月，P=0.000）。NSE及CYFRA21-1在评价疗效方面未见统计学意义。
　　 治疗一个月后三种肿瘤标志物的动态变化与患者疗效及预后的关系:经厄洛替尼治疗一个月(30天)时复查三种肿瘤标志物，以标志物水平下降20％为界值分组，结果显示，CEA水平下降≥20％的患者较CEA水平下降＜20％的患者获得更佳的客观缓解率(ORR)（分别为70.4％和20.7％，P=0.000）及客观有效率(DCR)（分别为100％和55.2％，P=0.000）。NSE水平下降≥20％的患者的客观有效率(DCR)优于NSE水平下降＜20％的患者，分别为100％和62.9％(P=0.004)。在CT等影像学基础上联合CEA、NSE水平下降≥20％为标准较单纯影像学检查明显提高对ORR及DCR的判断准确水平。以联合检测为标准判断药物疗效时总ORR为17.9％，较单纯影像学判断标准(46.4％)降低，差异有统计学意义，P=0.001。所有患者总的DCR为28.6％，较单纯影像学判断标准(76.8％)降低，差异有统计学意义，P=0.000。CEA水平下降≥20％的患者较CEA水平下降＜20％的患者获得更佳的PFS(分别为9.8和4.8，P=0.000)及OS(分别为19.0和11.3，P=0.000)。NSE水平下降≥20％的患者较NSE水平下降＜20％的患者获得更佳的PFS（分别为9.8和5.7，P=0.001）及OS（分别为18.7和12.8，P=0.001）。
　　 七、EGFR基因检测结果
　　 全组EGFR基因突变率为69.6％，大部分的突变集中在第19外显子的缺失和第21外显子的L858R点突变，其中腺癌与非腺癌EGFR基因突变发生率分别为82.1％(32/39)、41.2％(7/17)，二者比较差异有统计学意义(P=0.003)。其余临床因素如年龄、性别、病理分期、体能状态均与EGFR基因突变情况无统计学关系。EGFR基因突变阳性的患者较基因野生型患者有更高的客观缓解率(ORR)（分别为59.0％和17.6％，P=0.004）及更佳的客观有效率(DCR)(分别为87.2％和52.9％，P=0.014)。EGFR基因突变阳性的患者较基因野生型患者有更长的PFS（分别为8.5月和4.5月，P=0.004）及更佳的OS（分别为16.9月和10.8月，P=0.003）。
　　 八、肿瘤干细胞标志物ALDH1A1、CD133、CD34检测相关的结果
　　 ALDH1A1的阳性表达率为42.9％(24/56)，ALDH1A1表达阳性与阴性患者的客观缓解率(ORR)分别为20.8％和65.6％，（P=0.001）;疾病控制率(DCR)分别为58.3％和90.6％，(P=0.005);中位无进展生存期(PFS)分别为5.3月和8.7月，(P=0.009);总生存期(OS)分别为12.7月和16.6月，(P=0.041)。CD133的阳性表达率为37.5％，CD133表达阳性与阴性的患者ORR分别为4.8％和71.4％，(P=0.000);DCR分别为57.1％和88.6％，（P=0.018）;PFS分别为6.5月和8.0月,（P=0.269）;OS分别为14.8月和15.1月，(P=0.880)。CD34的阳性表达率为42.9％，CD34表达阳性与阴性的患者的ORR分别为16.7％和68.8％，(P=0.000);DCR分别为为58.3％和90.6％，（P=0.005），PFS分别为5.2月和8.8月，(P=0.005)，OS分别为12.0月和17.2月，（P=0.006）。ALDH1A1、CD133、CD34三者均阳性表达的患者为23.2％，三项指标均阳性表达的患者的ORR差于均阴性表达的患者，分别为0％和78.3％，(P=0.000);DCR分别为42.9％和91.3％，(P=0.005);PFS分别为4.8月和9.6月，（P=0.007），OS分别为10.9月和17.3月，(P=0.007)。
　　 九、联合检测
　　 PET-CTSUV值＜5的患者同时存在EGFR基因突变者的ORR为73.9％，高于未行PET-CT检查的EGFR基因突变患者(59.0％)，P=0.001。PET-CTSUV值＜5的患者同时有EGFR基因突变者的DCR为91.3％，高于未行PET-CT检查的EGFR基因突变患者(87.2％)，P=0.012。EGFR基因突变阳性同时伴有ALDH1A1、CD133、CD34三指标均阴性表达的患者的ORR优于单纯EGFR基因突变的患者，分别为85.0％和59.0％，(P=0.043)。
　　 结论:
　　 一、作为表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂的代表药物，厄洛替尼临床疗效较佳，患者可以获得较好的客观缓解率(ORR)及客观有效率(DCR)，并且可以获得较佳的无进展生存期及总生存期，且临床副反应轻。性别、病理类型、吸烟史是厄洛替尼疗效的临床病理预测因素。
　　 二、联合检测PET-CT的SUV值及EGFR基因突变情况可以较单一检测EGFR基因更为准确预测厄洛替尼的疗效，在本研究中这种联合检测对客观缓解率(ORR)的预测水平提高了14.9％，对客观有效率(DCR)的预测水平提高了4.1％，有助于临床工作中更加准确指导晚期非小细胞肺癌的一线治疗方案的制定。ALDH1A1、CD133、CD34的表达情况与EGFR-TKI药物对NCSLC的疗效相关，可以一定程度上反映患者预后。联合检测EGFR基因突变与ALDH1A1、CD133、CD34的表达情况可以一定程度上提高对EGFR-TKI药物疗效的预测水平，在本研究中这种联合检测对药物客观缓解率(ORR)的预测水平提高26.0％。
　　 三、非小细胞肺癌患者PET-CT的SUV值与EGFR-TKI药物疗效有相关关系，治疗前SUV值＜5的患者较SUV值≥5的患者疗效更佳。PET-CT的SUV值或有可能作为判断厄洛替尼疗效的一种手段，在无法进行EGFR基因检测时，或可作为选择EGFR-TKI治疗的一项参考依据。
　　 四、本研究发现在治疗过程中CEA、NSE水平下降≥20％可以作为提示治疗有效的标准之一。在影像学检查基础上联合检测血清CEA及NSE的动态变化较单纯依据影像学检测能更准确的监测厄洛替尼疗效。血清CEA、NSE水平同时下降程度大于20％的患者较下降程度小于20％的患者预后更佳。