碳青霉烯类药物联合舒巴坦或头孢哌酮对铜绿假单胞菌的药敏对比研究

摘要

目的：
　　 探讨碳青霉烯类药物联合应用舒巴坦或头孢哌酮等对铜绿假单胞菌(PA)的抗菌作用。
　　 方法：
　　 1.K-B法测定药敏及联合药敏120株临床株PA，来于山东大学齐鲁医院细菌室、山东中医药大学第二附院细菌室，均为致病菌株。K-B法测定药敏及联合药敏。根据抑菌环形态分为协同、相加、无关、拮抗。按药敏分为敏感菌株、多耐药菌株(Multipledrugresistant，MDR)、泛耐药菌株(Pandrugresistant，PDR)、广耐药菌株(ExtensiveDrugResistantXDR)。舒巴坦(Sulbactam，SUB)药敏纸片为自行制作，含量125μg。以协同+相加记为协同率。
　　 2.联合MIC测定:
　　 2.1抗菌药物原液配制选取48株PA进行下一步的联合MIC测定，分别为敏感菌株、MDR、XDR、PDR各12株。用pH7.2灭菌磷酸盐缓冲液将药物分别稀释为:比阿培南、亚胺培南、磷霉素、头孢哌酮、舒巴坦5120μg/mL;阿米卡星1280μg/mL;环丙沙星2560μg/mL。
　　 2.2单药孔板制备分别取上述各种抗菌药物原液10μL加入90μLMH肉汤中，然后做倍比稀释（取50μL放入第2孔中，依次类推）。共稀释16孔使得各浓度为:比阿培南、亚胺培南、磷霉素、头孢哌酮/舒巴坦、头孢哌酮、舒巴坦512、256～0.016μg/mL;阿米卡星128～0.004μg/mL;环丙沙星256～0.008μg/mL。
　　 2.3单药MIC测定将待检菌分别配置0.5麦氏单位菌悬液，用MH肉汤中稀释200倍（菌悬液中细菌的浓度大约为5.0×105cfu/mL）后取50μL加入各个孔中（此时各个药物的终点浓度应为放入MH肉汤菌液前浓度的1/2），混匀，37度放置18～24h，取出，测定待检菌的每种药物单独MIC。同时做阴性、阳性对照以及标准菌株质控。
　　 2.4联合用药孔板制备根据每种药物的MIC设计棋盘方阵的各孔浓度，共8×8孔，药物浓度范围是MIC的23倍到1/24倍。加药时，横排为A药物，从左到右，浓度从高到低，竖排为B药物，从上到下浓度从高到低，使得各孔中药物浓度不一样，初始放入浓度应为最终浓度的4倍。然后每孔加入配好的药物A药和药物B各25μL。
　　 2.5联合用药MIC测定在上述各孔中分别加入配好的含有待检菌的MH肉汤50μL，混匀孵育18-24小时取出读取各抗菌药物对应的MIC数值，同时做阴性对照、阳性对照标准菌株质控。
　　 2.6联合用药分级抑菌浓度（Fractionalinhibitoryconcentration，FIC）指数按下列公式计算:FIC指数=A药联合的MIC/A药单用的MIC+B药联合的MIC/B药单用的MIC。结果解释:FIC指数≤0.5为协同作用;0.5＜FIC指数＜4为无关作用;FIC指数≥4为拮抗作用。由于舒巴坦对铜绿假单胞菌天然耐药，在计算FIC时不计舒巴坦。
　　 3.联合杀菌曲线选用敏感菌株、MDR、XDR、PDR各2株，测定亚胺培南、比阿培南分别联合舒巴坦、头孢哌酮、阿米卡星的杀菌益线。因舒巴坦对铜绿假单胞菌不敏感，测定浓度均为亚胺培南、比阿培南的相同浓度。结合我们预试验结果，仅做0、8小时菌落计数。
　　 根据联合用药组菌落计数，较最有效的单药组减少≥2.0log10CFU/mL时，可定义为协同，减少≤1.0log10CFU/mL时为无关作用，联合后增加≥2.0log10CFU/mL时定义为拮抗。
　　 结果：
　　 1.K-B法单药药敏120株PA中，敏感菌株数分别为:阿米卡星86、磷霉素63、环丙沙星61、头孢他定66、头孢哌酮64、头孢哌酮/舒巴坦65、氨曲南67、哌拉西林/他唑巴坦64、亚胺培南83、比阿培南82、美罗陪南85、多粘菌素104。根据药敏，敏感菌56株，MDR36株，XDR13株，PDR15株。
　　 2.K-B法联合药敏与比阿培南联合最有效的依次为磷霉素（82株）、舒巴坦(51株)、阿米卡星（41株）、头孢哌酮/舒巴坦（36株）;与亚胺培南最有效的为磷霉素（82株）、舒巴坦(48株)、阿米卡星(44株);但亚胺培南与头孢哌酮/舒巴坦(44株)、头孢哌酮（68株）出现拮抗。碳青霉烯联合舒巴坦对不同敏感性PA的的协同率无差异。
　　 3.联合MIC测定联合MIC法与K-B法结果基本一致。与亚胺培南、比阿培南联合最有效的依次均为磷霉素(27株、42株)、阿米卡星（33株、31株）、舒巴坦（21株、22株）;但亚胺培南与头孢哌酮（24株）或头孢哌酮/舒巴坦（6株）出现拮抗。结合与舒巴坦的结果分析，亚胺培南主要与头孢哌酮产生拮抗。
　　 4.联合杀菌曲线比阿培南:联合舒巴坦协同8株，联合阿米卡星协同8株，联合头孢哌酮/舒巴坦协同4株，无关4株;联合头孢哌酮协同4株，无关4株。亚胺培南:联合舒巴坦协同8株，联合阿米卡星协同4株，无关4株，联合头孢哌酮/舒巴坦拮抗4株，无关4株，联合头孢哌酮拮抗4株，无关4株。
　　 结论：
　　 1.与比阿培南联合最有效的依次为磷霉素、舒巴坦、阿米卡星、头孢哌酮/舒巴坦;
　　 2.与亚胺培南最有效的为磷霉素、舒巴坦、阿米卡星;
　　 3.体外联合药敏发现，碳青霉烯类药物联合舒巴坦或磷霉素对于铜绿假单胞菌感染协同率最高，但亚胺培南与头孢哌酮联合有拮抗作用。
　　 第二部分
　　 地塞米松上调烟曲霉孢子侵袭力和A549细胞纤连蛋白表达
　　 目的：
　　 在体外环境中，比较烟曲霉孢子对受不同浓度地塞米松作用的A549细胞的侵袭力;探讨地塞米松对孢子侵袭力和A549细胞纤连蛋白表达量的影响。
　　 方法：
　　 (1)烟曲霉孢子侵袭力测定:分别用纤连蛋白抗体，不同浓度地塞米松预处理A549细胞后，将烟曲霉孢子侵袭A549细胞，4h后计数黏附在细胞表面和进入细胞的孢子总数，并将其占总孢子数的比率计为侵袭力。
　　 (2)应用实时荧光定量PCR技术(RT-PCR)检测上述各地塞米松浓度预处理A549细胞24h后，细胞纤连蛋白基因转录表达水平;应用western-blot和免疫组化技术检测不同浓度地塞米松预处理48h后，细胞纤连蛋白的表达量。
　　 结果：
　　 (1)纤连蛋白抗体室温下封闭处理细胞1h后，孢子对A549细胞的侵袭力较对照组下降24.8％,不同浓度地塞米松预处理A549细胞4h后，各组烟曲霉孢子的侵袭力无统计学差异，P＞0.05。而预处理24h后，25mg/L地塞米松组孢子侵袭力(24.66％±2.41％)高于对照组(19.17％±2.53％)组和1mg/L(19.93％±3.06％)组，5mg/L(22.47％±2.46％)高于对照组，p＜0.05。25mg/L地塞米松预处理24h合并纤连蛋白抗体封闭1h后，孢子侵袭率无明显下降。
　　 (2)RT-PCR细胞纤连蛋白基因转录相对表达量:25mg/L组细胞纤连蛋白基因转录相对表达量（9.19×103±1.2×10-3）高于对照组(4.61×10-3±1.54×10-3)和1mg/L组(6.20×10-3±1.93×10-3);5mg/L组的表达量(7.94×10-3±2.24×10-3)高于对照组，p＜0.05。地塞米松作用48h后，地塞米松浓度与细胞纤连蛋白合成量成正比。
　　 结论：糖皮质激素可以上调细胞表面纤连蛋白的表达而增强烟曲霉孢子的侵袭力，这可能是临床上大剂量、长期应用激素的患者容易感染烟曲霉的原因。

目录

声明

第一部分

摘要

符号说明

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分

摘要

符号说明

前言

材料和方法

讨论

结论

参考文献

致谢

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