耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌分子特征及替加环素联合头孢哌酮/舒巴坦对其抗菌作用的研究

摘要

目的:分析耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌（CRAB）的分子特征并评价替加环素联合头孢哌酮/舒巴坦对CRAB的体外、体内及细胞内活性。
　　方法:
　　(1)应用RT-PCR检测该院临床分离的非重复87株CRAB携带blaTEM，blaGES,blaSHV,blaKPC,blaCTX-M-1,blaVIM-1,blaVIM-2,blaIMP-1,blaIMP-2,blaSIM-1,blaNDM-1, blaOXA-23-like，blaOXA-24-like，blaOX-51-like，blaOXA-58-like等15个碳青霉烯酶耐药基因情况并测序。
　　(2)应用微量肉汤稀释法测定联合抑菌指数(FICI)，应用时间—杀菌曲线评价替加环素、头孢哌酮/舒巴坦及联合用药的体外效果。
　　(3)C57BL/6小鼠腹腔内注射最低致死剂量的CRAB建立腹膜炎/脓毒症小鼠模型，分析给药4h和18h小鼠血、肺、肝、脾、肾各脏器菌落数并观察病理。
　　(4)建立细胞内感染鲍曼不动杆菌模型:小鼠单核巨噬细胞RAW264.7与CRAB孵育4h，庆大霉素清除细胞外细菌，细胞培养24h。电镜观察细胞吞噬细菌及细胞内细菌的状态。评价各抗菌药物的细胞内外抑菌浓度(Cs)和最大相对效应(Emax)，并绘制量效曲线和时间—杀菌曲线。
　　结果:
　　(1)87株CRAB共携带4种碳青霉烯酶基因:blaOXA-51-like(97.7％)，blaOXA-23-like(95.4％)，blaTEM(85.1％)和blaOXA-58-like(2.3％)。耐药模式最多为:blaTEM+blaOXA-23+blaOXA-51-like(83.9％)。
　　(2)单药时:替加环素MIC＜Cmax的CRAB比例为57.5％，头孢哌酮/舒巴坦敏感率为12.6％。两药联合时，替加环素MIC＜Cmax的比例为96.6％，头孢哌酮/舒巴坦的敏感率为44.8％。联合抑菌指数(FICI)≤0.5的比例为25.3％。时间—杀菌曲线:1/2×MIC和1×MIC的联合用药在AB-8、AB-14、AB-44菌株呈协同作用，并能清除肉汤中的细菌，但替加环素联合等剂量的舒巴坦却在24 h后出现了细菌的再生长。
　　(3)腹膜炎/脓毒症小鼠死亡率:替加环素单药和联合用药较模型组(0％ VS100％，P＜0.05)和头孢哌酮/舒巴坦单药组(0％ VS50％，P＜0.05)明显下降。肺、肝、脾、肾等组织病理炎症明显减轻。给药4h:替加环素与联合用药组各脏器的菌落数均较模型组及头孢哌酮/舒巴坦组减少（替加环素:血5.64±0.16log10 CFU/mL，肺5.73±0.09log10CFU/g，肝6.34±0.17log10 CFU/g，脾7.11±0.17log10 CFU/g，肾5.98±0.13log10 CFU/g;联合用药组:血5.13±0.20log10 CFU/mL，肺5.09±0.06log10 CFU/g，肝5.81±0.16log10CFU/g，脾7.17±0.09log10 CFU/g，肾5.71±0.18log10 CFU/g;模型组:血7.18±0.27log10 CFU/mL，肺7.19±0.31log10 CFU/g，肝8.11±0.21 log10 CFU/g，脾8.16±0.26 log10CFU/g，肾7.67±0.31 log10 CFU/g;头孢哌酮/舒巴坦组:血6.27±0.26log10 CFU/mL，肺6.21±0.37log10 CFU/g，肝7.01±0.17log10 CFU/g，脾7.92±0.15log10 CFU/g，肾6.87±0.31 log10 CFU/g);联合用药与替加环素单药相比，肺、肝菌落数明显下降(-0.63±0.11log10 CFU/g、-0.53±0.23log10 CFU/g)。替加环素联合头孢哌酮/舒巴坦与替加环素联合等剂量的舒巴坦比较，作用4h各脏器的菌落数差异无统计学意义，但作用18h前者肝脏的菌落数明显下降（4.40±0.17log10CFU/g VS4.86±0.12log10 CFU/g，P＜0.05）。
　　(4)透射电镜观察到细菌在RAW264.7细胞液泡中复制。头孢哌酮/舒巴坦作用6h时并不能抑制细胞内细菌的生长，但是延长至24 h，可抑制细胞内细菌生长;而替加环素作用6h即能抑制细胞内细菌生长;联合用药细胞内的时间—杀菌曲线与替加环素单药基本重合。头孢哌酮/舒巴坦的抑菌浓度(Cs)在细胞内外基本都在MIC值附近，而替加环素细胞内Cs仅为细胞外的1/10×MIC。替加环素细胞内最大相对效应(Emax)为-2.37log10CFU/mg prot;头孢哌酮/舒巴坦细胞内Emax为-1.53 log10CFU/mg prot。
　　结论:
　　(1)本实验分离的CRAB主要携带blaOXA-51-like，blaOXA-23-like，blaTEM和blaOXA-58-like四种基因。
　　(2)替加环素联合头孢哌酮/舒巴坦较单药或替加环素联合等剂量舒巴坦对体外、体内的CRAB有更好的抗菌活性。
　　(3)替加环素对细胞内的CRAB有很好的活性;两药的联合在细胞内未表现出更优于替加环素的作用;无论单用或联合，这两种抗菌药物都不能彻底地清除细胞内的鲍曼不动杆菌。

目录

声明

缩略词表(Abbreviation)

摘要

前言

第一部分 耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的分子特征及药物敏感性

第二部分 替加环素联合头孢哌酮／舒巴坦对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌体外抗菌作用的研究

第三部分 替加环素联合头孢哌酮／舒巴坦对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌致小鼠腹膜炎／脓毒症的疗效

第四部分 替加环素与头孢哌酮／舒巴坦对巨噬细胞内耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的作用

结论

参考文献

综述一 鲍曼不动杆菌耐药机制文献计量分析

综述二 抗菌药物对细胞内致病原的药效学及药代动力学

攻读博士学位期间发表论文

致谢