弓形虫ROP16/GRA7复合DNA疫苗与基因佐剂B7-2对小鼠的免疫保护性研究

摘要

研究背景:刚地弓形虫是一种广泛寄生于人和动物有核细胞内的原虫，可引起人兽共患弓形虫病，严重威胁着人类健康和畜牧业生产。由于抗弓形虫药物不能达到理想的治疗效果，研制安全有效的疫苗来预防和控制弓形虫病成为当前的研究热点。
　　研究目的:构建编码弓形虫棒状体蛋白ROP16和致密颗粒蛋白GRA7基因片段的DNA复合疫苗，以及能表达小鼠共刺激分子B7-2的重组质粒作为分子佐剂，免疫接种昆明小鼠，评价疫苗的保护效果，以及分子佐剂的添加对疫苗诱导的免疫应答的影响，为优化弓形虫DNA疫苗免疫效果提供新思路。
　　研究方法:使用PCR技术分别扩增弓形虫抗原ROP16和GRA7基因以及小鼠共刺激分子B7-2基因，经TA克隆回收各目的片段，在测序正确后，亚克隆至真核表达载体pEGFP-C1中，构建重组真核表达载体pEGFP-ROP16、pEGFP-GRA7、pEGFP-ROP16-GRA7和pEGFP-B7-2;经PCR、双酶切和测序鉴定后，瞬时转染HEK293T细胞，荧光显微镜观察、SDS-PAGE和Westernblotting分析检测目的蛋白的表达情况;大量抽提重组质粒用于制备弓形虫DNA疫苗与基因佐剂B7-2，经肌肉注射昆明小鼠，检测分析接种前后小鼠细胞免疫与体液免疫指标的变化;最后进行攻击感染实验，观察小鼠生存时间，评价疫苗和佐剂的保护效果。
　　实验结果:构建了重组真核表达质粒pEGFP-ROP16、pEGFP-ROP16-GRA7和pEGFP-B7-2，经PCR、双酶切和DNA测序鉴定正确，各目的基因片段完整准确连接到表达载体上。pEGFP-ROP16、pEGFP-GRA7、pEGFP-ROP16-GRA7和pEGFP-B7-2转染的HEK293T细胞在荧光显微镜下观察均可看到绿色荧光，抽提的蛋白经SDS-PAGE和Westernblotting分析，均能检测到目的蛋白。动物实验数据显示，复合基因疫苗pEGFP-ROP16-GRA7组比单基因疫苗组和对照组诱导出更高水平的抗弓形虫IgG、IgG2a、IFN-γ和CD8+/CD4+，小鼠中位生存时间也有所延长;分子佐剂B7-2共免疫组与单用疫苗组相比上述指标得到进一步提高(P＜0.05);而各组间IgG1、IL-4和IL10水平无显著性差异。
　　结论:弓形虫棒状体抗原ROP16基因与致密颗粒抗原GRA7基因均可诱导昆明小鼠特异性的抗弓形虫体液免疫、Th1型和CD8+T细胞反应;ROP16和GRA7的复合基因疫苗比单一基因疫苗具有更强的保护性免疫;分子佐剂B7-2的使用有效增强了各抗原诱导的细胞免疫和体液免疫。