Let-7f和MMPI对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制研究

摘要

脑胶质瘤是神经系统中最常见的恶性肿瘤之一。胶质瘤患者的生存期比较短，大约为14个月。尽管近年来，胶质瘤手术技术、化疗、放疗等治疗手段，取得了很大进步，然而，胶质瘤确诊患者中，只有大约5％的患者生存期超过5年。胶质瘤的恶性行为主要是由于其快速的生长、血管形成、全脑广泛的浸润侵袭及多种化疗药物的耐药等。如何能有效的抑制胶质瘤细胞的生长和侵袭的能力，并且延长患者的生存时间和改善患者的生存状态是当今神经科学亟待解决的问题。然而，理解引起胶质瘤恶性行为的生物学作用和分子机制是目前首要解决的问题。
　　MicroRNA通过抑制转录或降解靶点mRNA来抑制蛋白的转录。大量的报道显示，在肿瘤细胞中，microRNA起到致癌基因或抑癌基因作用。MicroRNA在肿瘤细胞的分化、生长和细胞运动中扮演重要角色。相比较在正常脑组织中，在胶质瘤细胞中有大量的microRNAS异常表达，并参与到胶质瘤细胞的起源和发展。Let-7f是Let-7家族成员，位于9q22.3。Let-7f在不同的肿瘤中表达是不同的，在许多肿瘤中表达下调，包括卵巢癌、肉瘤、胃癌等。然而，Let-7f在乳腺癌和肝癌中的表达是上调的。Let-7f主要的生物学功能是参与到肿瘤细胞的起源和进展。目前，有报道显示Let-7f在胶质瘤细胞中表达下调。然而，Let-7f对胶质瘤细胞的生物学作用及机制并不十分清楚。
　　基质金属蛋白酶(MMPs)在胶质瘤细胞的运动过程中发挥重要的作用，因此，MMPs被认为是胶质瘤治疗的重要靶点之一。然而，不幸的是，基质金属蛋白酶抑制剂(MMPI)对胶质瘤患者治疗的结果并不令人满意，没有取得显著的治疗效果。因此，研究MMPI失败的原因是必要的。肿瘤细胞具有可塑性，在不同的环境中能够采取间充质样或阿米巴样这两种不同方式来运动。一些肿瘤细胞采取间充质-阿米巴运动模式的转换(MAT)来补偿MMPI对肿瘤细胞侵袭的抑制作用，并且MAT是MMPI治疗肿瘤失败的重要原因和机制。然而，在胶质瘤在胶质瘤治疗中，很少报告MMPI是否能够引起胶质瘤（间充质-阿米巴转换）(MAT)。更重要的是本研究发现RhoA/ROCK信号在MAT过程中起关键作用，联合应用MMPI和RhoA/ROCK通路抑制剂，能够有效抑制胶质瘤细胞的运动能力。
　　本课题分两部分:分别研究了Let-7f和MMPI对胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭的影响，并探讨其机制，以期为胶质瘤的靶向治疗提供理论基础和实践依据。
　　第一部分: Let-7f对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制研究
　　1.胶质瘤组织和细胞系Let-7f的表达下调
　　首先，我们分别检测了胶质瘤组织样本、正常脑组织和胶质瘤细胞系中Let-7f的表达情况。结果显示，Let-7f在胶质瘤组织样本中比正常脑组织中表达下调，其表达情况与胶质瘤级别的增高呈负相关。同样，Let-7f在胶质瘤细胞系T98G、U87和A172比在正常星型细胞系表达下调。另外，我们统计分析了在胶质母细胞瘤中Let-7f表达与患者生存期的关系，结果发现患者的低生存期伴随着Let-7f的低表达。这些结果暗示了Let-7f在胶质瘤细胞中可能发挥抑癌基因的作用。
　　2.在体外胶质瘤细胞中过表达Let-7f抑制胶质瘤细胞的增殖能力
　　U87和A172细胞转染后，采用CCK-8法检测，分别在24、48、72和96小时，检测胶质瘤细胞的增殖能力。结果显示:胶质瘤细胞Let-7f过表达组比未转染组和阴性对照组细胞的增殖能力下降;Edu检测实验也表明了过表达Let-7f显著的抑制胶质瘤细胞增殖能力。另外，克隆形成实验的结果显示:Let-7f过表达组的克隆数目比未转染组和阴性对照组明显减少，这说明过表达Let-7f能够长时抑制胶质瘤细胞的生长能力。这些实验结果表明了在体外过表达Let-7f能够抑制胶质瘤细胞生长能力。
　　3.在体外胶质瘤细胞中过表达Let-7f抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭
　　Transwell侵袭和迁移实验检测Let-7f对胶质瘤细胞运动能力的影响，结果显示:胶质瘤细胞在转染48小时后，Let-7f过表达组细胞的侵袭和迁移能力比空白组和阴性对照组明显降低。MMP2和MMP9蛋白水平降低。这些结果表明了，在体外胶质瘤细胞中过表达Let-7f抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭的能力。
　　4.Periostin是Let-7f的直接靶点
　　我们查阅Microrna、Targetscan和miRBase等数据库，发现periostin与Let-7f在3'UTR区具有潜在的结合位点。荧光素酶报告基因法和western blot检测的结果进一步验证了periostin为Let-7f直接靶点基因。
　　5.Periostin涉及到Let-7f对胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的调节。
　　我们选用干扰RNA方法敲除periostin，进一步检测periostin敲除后，对细胞行为的影响，发现periostin敲除后，细胞侵袭、迁移和增殖能力下降。胶质瘤细胞过表达periostin能够部分逆转Let-7f对胶质瘤细胞的抑制作用。
　　6.在体内，Let-7f抑制胶质瘤细胞恶性表现
　　在胶质瘤皮下异位模型中瘤内注射Let-7f，结果显示:Let-7f处理组中肿瘤的体积和重量比空白对照和阴性对照组明显减小。颅内模型显示了:Let-7f处理组中，肿瘤组织与正常组织的边缘是清晰的。这些结果表明在体内，Let-7f能够抑制胶质瘤的增殖和侵袭。
　　总之，本研究发现Let-7f在胶质瘤低表达，过表达Let-7f能够在体内外抑制胶质瘤增殖、侵袭及迁移的能力，periostin为Let-7f靶点基因，并进一步表明了Let-7f有希望成为胶质瘤诊断和治疗的新靶点。
　　第二部分:MMPI对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制研究
　　1.MMPI(ILO)对胶质瘤细胞活力和侵袭能力的影响
　　采用不同浓度的MMPI(0-100μM)处理胶质瘤细胞24小时，CCK-8检测的结果:0-50μM没有对胶质瘤有明显的影响，当药物浓度大于75μM时明显抑制胶质瘤细胞的活性。我们选用MMPI(50μM)作为后续实验的使用浓度。MMPI(50μM)处理胶质瘤细胞24小时，胶质瘤细胞仍能保持较高的侵袭迁移能力。
　　2.MMPI(ILO)诱导胶质瘤细胞采用阿米巴样运动方式
　　为了研究MMPI对细胞运动方式的影响，我们进一步检测ILO对胶质瘤细胞形态和骨架的影响。结果显示，MMPI诱导胶质瘤细胞由长梭形转变成圆形，细胞骨架有纵行排列转变为环状排列。同时，MMPI诱导RhoA/ROCK/MLC信号活化。
　　3.RhoA/ROCK介导了MMPI(ILO)诱导胶质瘤细胞阿米巴样转变
　　我们选用了RhoA/ROCK通路抑制剂Y-27632处理细胞，结果显示:Y-27632处理后，由ILO诱导形成的圆形细胞比例下降，并且胶质瘤细胞的侵袭能力进一步下降。
　　4.P115RhoGEF参与了MMPI(ILO)诱导的RhoA的活化，
　　为了进一步探究RhoA的活化机制，我们检测P115RhoGEF是否参与了MMPI(ILO)诱导的RhoA活化，结果显示:MMPI能够诱导胶质瘤细胞P115RhoGEF的活化，P115RhoGEF-siRNA后，RhoA活性降低，MMPI诱导的圆形细胞比例下降和阿米巴样侵袭迁移能力下降。
　　5.在体内联合应用MMPI(ILO)和ROCKI能够延长了荷瘤裸鼠的生存时间
　　我们构建胶质瘤细胞原位模型，腹腔注射MMPI和ROCKI结果显示:联合应用MMPI和ROCKI比单独应用MMPI或ROCKI裸鼠的生存时间明显延长。
　　总之，MMPI(ILO)诱导胶质瘤细胞活化P115RhoGEF/RhoA/ROCK信号发生MAT，本研究解释了MMPI治疗胶质瘤失败的原因及机制，在体内外联合应用MMPI和ROCKI能够有效抑制胶质瘤的侵袭能力，联合试剂的应用弥补了MMPI抑制胶质瘤侵袭的不足。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分：Let-7f对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

附图

参考文献

第二部分：MMPI对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

附图

参考文献

其他研究：periostin对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制研究

参考文献

致谢

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