主要海藻多糖降解酶活性架构及其降解模式分析

摘要

海藻以其丰富的含量和显著的工业价值日益被人们重视而。海洋藻类种类繁多，主要以褐藻和红藻为主。琼胶、卡拉胶和褐藻胶等海藻胶是海洋藻类的主要成分。面对如此庞大的海藻多糖生物质，海洋异养微生物能够消化高分子量的海藻多糖有机物，将其分解为低分子量物质。海洋不计其数的与海藻多糖降解相关的微生物，利用自身基因所编码表达的糖苷水解酶(GH)和糖苷裂解酶(PL)参与重要的代谢途径。从分子层面进行分析和表征GH和PL相关酶类将会为海洋碳循环研究提供新的思路。
　　本项研究主要对海洋和陆地环境样品进行样品富集和菌株筛选，希望获得能够降解海藻多糖的的菌种和基因资源。利用结构生物信息学分析海藻多糖降解酶底物识别的特异性和混杂性模式，推测酶参与催化的关键氨基酸，这将能深入地理解海藻多糖酶高效降解海藻多糖的分子基础。本研究集中于活性架构区域，推测关键氨基酸残基功能，试图阐明酶催化底物的机制。同时也对分离到的其它有特定功能的新菌进行分离和鉴定。
　　1.对近海和陆地环境样品进行了广泛地筛选，获得了两株细菌新物种并对其进行物种鉴定
　　分析发现，在威海近海海参养殖池的沉积物以及西藏纳木错湖湖水样品中分离到一些潜在的新种，本研究对分离到的标号为N39T和XZ17T两株疑似新菌进行了分类鉴定，确定了其系统发育地位。分子进化分析、表型分析、化学组分分析和生理生化分析的结果表明:N39T和XZ17T代表了科迪单胞菌属和类诺卡氏属的一个新种，根据以上特征分析，将其分别命名为底泥科迪单胞菌Kordiimonassediminis和黄色类诺卡氏菌Nocardioides gilvus。
　　2.利用结构生物信息学方法分析了三类海藻多糖降解酶底物识别特异性和混杂性的模式
　　利用结构生物信息学的方法探索了三类海藻多糖降解酶（琼胶酶，卡拉胶酶和褐藻胶裂解酶）活性架构区域底物结合模式。分析显示，五个海藻多糖降解酶家族的活性架构处某些氨基酸残基相比全酶其频率升高，特别是碱性氨基酸H和R升高幅度最大。这表明极性氨基酸残基能够与底物的特异性基团如硫酸根、羧酸根或内醚氧之间形成氢键或静电相互作用，以此来识别海藻多糖底物。-2和+3亚位点保守氨基酸残基要明显多于其它亚位点，这也是每个家族的共同识别位点。进一步研究发现，每一类的同工酶在降解同一种底物时扮演着不同的角色，往往以一种合作的方式共同降解。结合基因组测序发现，来源于同一种微生物的不同家族的酶能够协同降解同一种底物，也许会更高效或更完全。
　　3.完成了褐藻胶裂解酶AlyV4的异源表达、分离纯化，并对其酶学性质进行了表征
　　将海洋弧菌Vibrio sp.QY104中表达的褐藻胶裂解酶基因alyV4连pET-28a(+)载体上，将其转入E.coli BL21(DE3)获得了后重组蛋白的活性表达。对AlyV4的酶学性质检测分析显示，该酶的最适温度和pH分别为40℃和pH7.6。底物专一性分析表明，该酶能够降解褐藻酸的三种成分即PMG、PM和PG。构建进化关系得知AlyV4属于PL7-5家族。该酶的比酶活为5686.28 U/mg，Km和Kcat分别为1216 mg/mL和6274.03 S-1。
　　4.对PL7家族褐藻胶裂解酶AlyV4活性架构处关键氨基酸残基功能进行了分析
　　通过活性架构处保守氨基酸残基及Lid-loop上关键氨基酸残基的突变，发现各突变体酶活均降低85％以上，可以推测出这些氨基酸残基在酶的催化过程中起到关键作用。荧光光谱法可以灵敏测得各突变体的结合力，结果发现突变体的底物结合力下降，最多降低了45％左右。酶活与底物结合力降低程度的不对等程度强烈暗示着酶的催化过程不仅只是包括底物结合、催化和产物释放的过程，在底物的结合与催化之间也可以细分为几个阶段。最初酶与底物之间进行结合以后，活性架构处的关键氨基酸残基接着要发挥辅助催化断键的功能，例如-1亚位点的残基需要辅助糖环经过从船式到椅式的转变从而保证催化残基能够顺利催化。对产物的荧光辅助糖电泳表明，突变体S76A/R和Y81A/N的产物谱与野生型相比，其降解四糖以上底物的能力降低，说明单个位点的突变即可导致催化模式的改变。通过对活性架构处关键氨基酸残基功能的分析，可为该酶后续的分子改造奠定了理论与结构基础，具有重要意义。

目录

声明

摘要

缩略词

第1章 绪论

1．1 海藻多糖

1．1．1 海藻多糖的来源与结构

1．1．2 海藻多糖的理化性质

1．1．3 海藻多糖的生物活性

1．1．4 海藻多糖的应用

1．2 海藻多糖降解酶

1．2．1 琼胶酶

1．2．2 卡拉胶酶

1．2．3 褐藻胶裂解酶

1．3 褐藻胶裂解酶的研究现状

1．3．1 褐藻胶裂解酶的催化机制

1．3．2 褐藻胶裂解酶的分类

1．3．3 褐藻酸裂解酶的酶学性质

1．3．4 褐藻酸裂解酶的序列和结构分析

1．3．5 褐藻胶裂解酶中Lid-loop结构对于底物结合的识别机制

1．4 立题依据与主要内容

第2章 海藻多糖降解细菌的筛选及两株新菌的鉴定

2．1 材料与方法

2．1．1 菌株

2．1．2 培养基与溶液

2．1．3 主要仪器和试剂

2．2 实验方法

2．2．1 样品采集及处理

2．2．2 基于遗传学的分类鉴定

2．2．3 微生物表型及生理生化特征的测定

2．2．4 化学组分分析鉴定

2．2．5 菌株保藏

2．3 实验结果与分析

2．3．1 底泥科迪单胞菌(Kordiimonas sediminis sp．nov．)N39T的多相分类鉴定

2．3．2 黄色类诺卡氏菌(Nocardioides gilvus sp．nov．)XZ17T的多相分类鉴定

2．4 本章小结

第3章 三种海藻多糖降解酶活性架构生物信息学分析

3．1 材料与方法

3．1．1 生物信息学分析软件与网站

3．1．2 数据获取与筛选

3．1．3 多序列比对

3．1．4 活性架构处氨基酸残基的筛选

3．1．5 海藻多糖降解酶家族活性架构区域氨基酸频率统计

3．1．6 海藻多糖降解酶家族活性架构区域活性中心序列谱制作

3．2 结果与分析

3．2．1 海藻多糖降解酶家族活性架构处氨基酸频率和偏好性分析

3．2．2 海藻多糖降解酶家族活性架构不同亚位点处氨基酸统计分析

3．2．3 海藻多糖降解酶家族活性架构的序列谱分析

3．2．4 不同的海藻多糖降解酶家族底物的识别特异性和混杂性模式

3．3 小节与讨论

第4章 褐藻胶裂解酶AlyV4的异源表达、分离纯化与酶学性质研究

4．1 材料与方法

4．1．1 菌株与质粒

4．1．2 主要仪器和试剂

4．1．3 常用培养基与缓冲液

4．2 实验方法

4．2．1 大肠杆菌BL-21(DE3)异源表达蛋白及亲和层析

4．2．2 酶学性质测定

4．2．3 荧光辅助糖电泳(FACE)表征产物谱的变化

4．2．4 重组酶的催化动力学常数的测定

4．2．5 重组酶的降解产物分析

4．3 实验结果

4．3．1 AlyV4序列分析

4．3．2 大肠杆菌BL-21(DE3)异源表达蛋白及亲和层析

4．3．3 重组酶酶活及酶学性质测定

4．3．4 酶的催化动力学常数的测定

4．3．5 酶的降解产物分析

4．3．6 AlyV4褐藻胶裂解酶的家族分类地位

4．4 小结与讨论

第5章 PL7家族褐藻胶裂解酶AlyV4活性架构处关键氨基酸残基的功能分析

5．1 材料与方法

5．1．1 主要试剂与设备

5．1．2 AlyV4活性架构区域关键氨基酸突变体蛋白的制备

5．1．3 突变体蛋白的酶活测定及催化动力学常数的测定

5．1．4 野生型及突变体蛋白的荧光光谱的测定

5．1．5 AlyV4褐藻胶裂解酶的同源模建

5．1．6 荧光辅助糖电泳表征野生型及突变体蛋白的产物谱变化

5．2 结果与分析

5．2．1 AlyV4褐藻胶裂解酶同源模建及蛋白质中氨基酸组成分析

5．2．2 AlyV4活性架构中突变位点的功能分析和预测

5．2．3 AlyV4活性架构中关键氨基酸突变位体酶活测定

5．2．4 AlyV4活性架构中关键氨基酸突变体的荧光光谱定量分析

5．2．5 催化所必需的氨基酸对于催化过渡态的重要作用

5．2．6 AlyV4及其突变体蛋白的产物谱分析

5．3 本章小结

第6章 总结与展望

6．1 总结

6．2 展望

附录

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文和参加科研情况