山东某生猪养殖县农村居民产ESBL大肠埃希菌流行现状及分子分型研究

摘要

研究背景
　　细菌耐药可以引起患者抗生素使用后效果不明显，医治难度增加甚至病死率上升等严重后果，已经成为全球共同面临的严峻公共卫生问题之一。超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrumbeta-lactamases，ESBL)是一类能够水解β-内酰胺类药物的酶，ESBL可通过质粒上的编码基因完成在菌株之间水平传播耐药性，是肠杆菌科细菌出现抗生素耐药的主要方式。产ESBL菌株中最常见的是大肠埃希菌，其在医院患者中的携带率为31.5％～55.8％，在山东省农村居民中的携带率可达42％。ESBL的耐药基因型主要有CTX-M、SHV和TEM，我国临床患者中流行的主要是CTX-M，尤其是CTX-M-14和CTX-M-15。
　　山东省是全国的养猪大省，除规模化养殖外，还有数量众多的散养户，由于与养殖动物接触密切，这些养殖户居民是动物源耐药菌传播给人的重点人群。调查研究该类人群的ESBL携带情况，有助于掌握当前山东省养殖地区农村居民中产ESBL大肠埃希菌的流行现状，耐药情况及分子分型特点，进而找到耐药菌传播途径，为今后控制抗生素耐药的蔓延提供理论依据。
　　研究目的
　　1.了解山东省养殖地区农村居民产ESBL大肠埃希菌的流行现状;
　　2.掌握山东省养殖地区农村居民产ESBL大肠埃希菌的药物敏感性和耐药基因特点;
　　3.描述山东省养殖地区农村居民产ESBL大肠埃希菌的分子分型特点;
　　4.通过分析养殖地区农村居民产ESBL大肠埃希菌的耐药基因特点和分子分型特点，探讨耐药菌传播途径，从而对今后控制抗生素耐药的蔓延提供理论依据。
　　研究方法
　　1.样本采集:本研究基于“IMPACT”中-瑞国际合作项目，项目选择山东省某生猪养殖县某养殖镇的12个村作为研究现场，本研究在12个村中随机抽取4个村，在每村居民中随机抽取40位成年常住居民，采集其粪便样本，并收集居民的年龄、性别和养猪情况;
　　2.产ESBL大肠埃希菌的分离和鉴定:采用ESBL筛选性培养基直接筛选目的菌株，利用VITEK质谱仪完成菌株型别的鉴定。
　　3.ESBL确证试验和药物敏感性试验:根据2015版CLSI指南，采用纸片法进行ESBL确证试验，采用琼脂稀释法进行药物敏感性试验。
　　4.耐药基因检测:通过PCR扩增、毛细管电泳以及DNA测序的方法分析产ESBL大肠埃希菌所携带的耐药基因型别。
　　5.分子分型分析:通过MLST和PFGE两种方法进行分子分型分析。
　　主要结果
　　1.产ESBL大肠埃希菌的携带率
　　160位农村居民中有130人携带产ESBL的大肠埃希菌，携带率为81.3％，共分离到184株目的菌株。各村居民的携带率分别为75.0％、80.0％、77.5％和92.5％。女性和男性居民的携带率分别为84.5％和78.7％，养猪居民和非养猪居民的携带率为83.3％和80.0％，“＜50岁”居民、“50～59岁”居民和“≥60岁”居民的携带率分别为86.8％、87.0％和63.2％。
　　2.产ESBL大肠埃希菌的药物敏感性
　　(1)研究菌株对14种抗菌药物的药物敏感性，除去动物专用药物氟苯尼考，剩余13种属于11类。分析产ESBL大肠埃希菌对这11类人常用抗菌药的耐药谱，多重耐药率达91.8％，耐3-5类药物的比例为56.0％(103/184)，耐6-8类药物的比例为35.9％(66/184)。养猪是导致居民对氟苯尼考重度耐药(MIC=64)的危险因素（OR=2.121，95％CI:1.034～4.353），同时也是导致居民＞5重耐药的危险因素(OR=1.995，95％CI:1.080～3.686)。产ESBL大肠埃希菌对CTX、TET和SXT这三种抗菌药物的耐药率超过80％，耐药率分别为100.0％、87.0％、82.1％;耐药率居于其次的是CIP(64.7％)、FFN(56.5％)、GEN(53.8％)、PTZ(31.0％)、FO(29.9％)、AMC(20.1％)、NIT(13.0％);耐药率低于10.0％的抗菌药物有AMI(7.1％)、CFX(4.9％)、MEM(0.0％)、TGC(0.0％)。
　　(2)检测产ESBL大肠埃希菌中耐药基因CTX-M、SHV和TEM的携带情况，结果显示CTX-M的检出率为100.0％，共检出10种亚型，优势型是CTX-M-14，占37.0％(68/184)，其次是CTX-M-55、CTX-M-65和CTX-M-15，分别占17.4％(32/184)、16.3％(30/184)和14.1％(26/184)。SHV和TEM均未检出。
　　3.分子分型
　　(1)在184株产ESBL的大肠埃希菌中随机选择54株进行PFGE分子分型分析，结果这54株菌株属于35种基因指纹图谱型别，同源性在63.8％到93.0％之间。指纹图谱显示不同村居民之间、养猪居民和非养猪居民之间，所分离的产ESBL大肠埃希菌都存在同源性大于80％的现象，即菌株间存在同源性。
　　(2)MLST结果显示，184株产ESBL的大肠埃希菌中有172株基因序列与MLST基因库中的ST序列匹配，属于81种ST(sequencetypes)型，其余12株未找到匹配的ST型，属于新发现，下一步将提交到MLST网站对新ST型命名。本研究中大肠埃希菌的ST型呈现多样性，型别最多的是ST10，占8.1％(14/172);其次分别为ST38型，占5.8％(10/172);ST48型，占5.8％(10/172);ST6338型，占3.5％(6/172);ST46型，占2.9％(5/172);ST648型，占2.9％(5/172)。其余75种ST型仅有5株以下与其对应。
　　结论
　　1.山东农村养殖地区居民中产ESBL大肠埃希菌广泛流行，耐药形势比较严峻;
　　2.山东农村养殖地区居民所携带的产ESBL大肠埃希菌分子分型表现为多样性;
　　3.动物源性耐药基因CTX-M-55和CTX-M-65在本地区居民中广泛流行，畜禽中广泛流行的序列型ST10在本地区居民中多见，可初步证明耐药性有从畜禽向人类传播的趋势。

目录

声明

摘要

符号说明

1 细菌耐药

2 产ESBL大肠埃希菌的流行现状

3 药物敏感性试验

4 耐药基因

5 分子分型方法

6 研究目的与意义

7 技术路线

1 研究对象

2 实验仪器

3 实验方法

4 分析方法

5 质量控制

1 调查对象基本情况

2 细菌分离鉴定

3 居民产ESBL大肠埃希菌携带率

4 耐药性

5 分子分型

6 严重耐药菌株分析

讨论

1 产ESBL大肠埃希菌的携带率

2 产ESBL大肠埃希菌的耐药性

3 分子分型

结论

创新性与局限性

附录

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文