TPO受体激动剂治疗原发免疫性血小板减少症的相关研究

摘要

第一部分TPO受体激动剂治疗原发免疫性血小板减少症患者后细胞因子的改变
　　研究背景:
　　原发免疫性血小板减少症（primary immune thrombocytopenia，ITP）是以体液免疫和细胞免疫介导的血小板过度破坏和巨核细胞成熟障碍为主要特征的获得性免疫性出血性疾病。近年来，越来越多的研究已经证实T细胞异常在ITP的发病中起着重要的作用，其中辅助性T细胞不仅在抗血小板抗体产生过程中起作用而且能促进ITP患者抗血小板T细胞的活性。ITP患者会表现出Th1和Th17细胞增强而Th2细胞减低并伴有CD4+CD25+Foxp3+的调节性T细胞受损的极化趋势。并且有研究报道ITP患者体内细胞毒性T细胞介导的血小板破坏是增强的。但是具体的作用机制仍需进一步研究。
　　促血小板生成素作为最重要的刺激血小板生成的细胞因子，在ITP患者中表现出含量的相对不足，因此一系列TPO受体激动剂在ITP治疗中得到了很好的发展。其中艾曲泊帕和罗米司亭已经被美国食品药品管理局列入了ITP治疗的常规二线用药，而在我国重组人促血小板生成素(rhTPO)也已经作为激素抵抗和复发ITP患者的推荐用药得到了广泛的应用。TPO-RAs用药后往往能很快见效，但是一旦停药血小板又常常会降回到用药前水平，因此其单药治疗常常难以获得长期的不依赖药物的缓解。
　　在各种自身免疫性疾病中细胞因子介导的免疫都发挥着重要的作用。研究发现，ITP患者的免疫失衡与其细胞因子谱的异常息息相关。而大剂量地塞米松、脾切除、美罗华等治疗手段都被发现在疾病缓解的同时伴有细胞因子异常的纠正。尽管TPO-RAs用于ITP临床治疗已经数年，但是对其治疗过程中是否伴有细胞因子改变仍然不清楚。
　　研究目的:
　　1.验证TPO-RAs治疗激素耐受/复发型ITP的疗效和副作用
　　2.评价TPO-RAs对ITP患者细胞因子改变的影响，从而探寻其起效和作用机制
　　研究方法:
　　1.选取26例慢性激素抵抗/复发型ITP患者，均为单药口服艾曲泊帕或者皮下注射重组人血小板生成素（沈阳三生，特比奥）治疗。其中艾曲泊帕为25mg每天一次，可根据血小板计数调节用药剂量到50或75mg每天以维持血小板计数在≥50×109/L。特比奥则为每天皮下注射300U/Kg体重，可调节为隔天一次以保证血小板计数不超过100×109/L。用药前检测血常规及肝肾功。用药过程中每周监测血常规。另外选取15位健康志愿者作为对照组。
　　2.治疗六周后再次检测血常规和肝肾功。根据患者血小板计数来分析疗效。根据血小板计数和有无出血将患者分为完全有效组，有效组和无效组。
　　3.取ITP患者治疗前和治疗后血清，并抽取健康志愿者血清。用ELISA法分别检测血清中IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-17A和TGF-β1含量，对治疗前患者与健康志愿者，患者治疗前后，以及有效组和无效组患者治疗前后的细胞因子进行对比。
　　4.取患者治疗前后以及健康志愿者的外周血，提取RNA，用实时定量PCR技术检测IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-17A，TGF-β1以及RORγt的mRNA水平，分别对治疗前患者与健康志愿者，患者治疗前后，以及有效组和无效组患者治疗前后的这些细胞因子mRNA表达水平进行对比。
　　研究结果:
　　1.本次实验中26位患者TPO-RAs治疗有效的有19位（有效率为73.08％），其中CR的有7位（占26.92％），治疗无效的有7位为（占26.92％）。艾曲泊帕治疗前两周有两位患者因血小板计数小于10×109/L而接受了血小板输注。全部患者在治疗过程中均耐受良好。3位患者（2位是艾曲泊帕治疗一位是特比奥治疗）出现了一过性肝酶升高，但在保肝治疗后恢复正常。4位出现头疼，2位出现疲劳，2位出现恶心和腹泻。
　　2.ITP患者治疗前血浆中IL-2和IFN-γ水平明显高于健康对照者，而IL-4和TGF-β1则明显低于健康对照者，两者之间IL-17水平无明显差异。TPO-RAs治疗后患者的IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-17A水平并没有发生明显的改变。但TGF-β1水平却明显升高(P=0.008)。治疗后TGF-β1水平与健康对照组无明显差异。
　　3.治疗前ITP患者IL-2，IFN-γ，IL-17A以及RORγt的mRNA水平明显高于健康对照者，而IL-4和TGF-β1的mRNA水平则明显低于健康对照者。同样治疗前后患者IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-17A以及RORγt的mRNA水平都没有明显改变。而TGF-β1的mRNA水平明显升高(P=0.039)，与健康对照组无统计学差异。
　　4.治疗有效组和无效组IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-17A的水平和mRNA水平与治疗前相比均无明显改变。同样，RORγt的mRNA水平在有效组和无效组治疗前后也是没有明显改变。但治疗有效组TGF-β1不管血清水平还是其mRNA水平均比治疗前明显升高（P＜0.05），而治疗无效组TGF-β1则无明显变化。
　　研究结论:
　　TPO-RAs能有效促进激素抵抗或复发的ITP患者血小板升高，并且副作用轻微，患者耐受良好。但是单一TPO-RAs治疗不能纠正患者细胞因子的改变，不能改善ITP患者向Th1型细胞因子偏移的免疫失衡状况。仅能使TGF-β1水平升高。这对于知道临床上TPO-RAs联合用药提供了一定的理论依据。
　　第二部分rhTPO治疗妊娠合并原发免疫性血小板减少症动物模型的研究
　　研究背景:
　　妊娠期血小板减少是指妊娠期血小板计数小于150×109/L，在妊娠期妇女中常见。其发生原因有很多，其中由ITP引起的妊娠期血小板减少，约占妊娠期血小板减少的4.1％。ITP在孕妇中发病率为1/1000-1/10000，由于母体的IgG型抗血小板抗体可通过胎盘到达胎儿循环，妊娠合并ITP患者除了母体会有ITP常见临床症状外，也会导致胎儿血小板减少及出血，随着妊娠后期血小板渐进性的减低，妊娠合并ITP患者围产期死亡率和早产发生率均明显升高。
　　妊娠合并ITP的治疗是很复杂的，要达到最佳效果需要产科、血液科及新生儿科医师协作完成，其用药治疗选择可参照非妊娠ITP患者。每一种治疗选择均需考虑其对母亲和胎儿的有效性及安全性，并选择对母婴损害最小的治疗手段。目前对妊娠合并ITP患者的一线治疗主要包括糖皮质激素和静脉丙种球蛋白(IVIG)等，对于一线治疗无效或者副作用不能耐受的妊娠合并ITP患者，可选择的治疗手段非常有限。国内一系列研究已证实重组人促血小板生成素(rhTPO)治疗慢性ITP有很好的疗效和较好的安全性。也已有报道rhTPO用于妊娠合并ITP治疗效果显著且对母体和胎儿无明显毒副作用，但是对rhTPO治疗妊娠合并ITP的疗效和安全性仍需要可靠的动物实验支持。
　　研究目的:
　　1.建立妊娠合并ITP小鼠模型
　　2.利用小鼠模型研究rhTPO对于妊娠合并ITP治疗的疗效和安全性
　　3.利用妊娠合并ITP小鼠模型进一步验证rhTPO治疗对Treg和血清TGF-β1水平的影响。
　　研究方法:
　　1.建立妊娠合并ITP小鼠模型:C57适龄雌鼠与适龄雄鼠2:1合笼，每日晨8时观察阴栓或行阴道涂片，观察到阴栓或阴道涂片见精子者定义为孕0天，于孕0天给予孕鼠腹腔注射抗血小板抗体，首次注射5mg/只，每48小时补注射一次5mg/只，定期测定血小板水平，并根据血小板计数水平适当增加抗体剂量。以建立被动型妊娠合并ITP小鼠模型。
　　2.妊娠合并ITP小鼠随机分为4组，于孕0天采血测定初始血小板水平。后注射抗血小板抗体，于孕1天起分别每天皮下注射0.9％生理盐水，150U/Kg体重rhTPO，1500U/Kg体重rhTPO，15000U/Kg体重rhTPO各100ul，连续注射14天，每日观察母鼠情况，直至妊娠终止。于孕1，3，7，10，14天及妊娠终止时取血测定血常规。，于妊娠终止时留取血清测定血清生化六项，于妊娠终止随机取每组一半母鼠处死，留取骨髓，行骨髓涂片和网状纤维染色。并取每组所生小鼠随机选取16只测定出生小鼠血常规。剩余每组一半孕鼠仍与新生小鼠同笼观察小鼠成活情况至少3周。
　　3.与妊娠终止随机所取每组15只母鼠处死后，血清利用ELISA法测定TGF-β1水平，分离外周血和脾脏，利用流式细胞术测定每组母鼠Treg情况。
　　研究结果:
　　1.妊娠合并ITP小鼠模型血小板变化情况:注射抗血小板抗体后第一天，孕鼠血小板即降低到最低水平，随着造模时间延长，孕鼠血小板会逐渐升高，到造模第10天，血小板水平仍显著低于对照组孕鼠。可认为妊娠合并ITP小鼠模型可用。
　　2.四组小鼠一般情况，食欲，精神状况等在给药期间和停药期间均无明显变化。局部注射部位未见红肿，实验期间8只孕鼠发生难产（3只NS组，2只低剂量组，1只中剂量组，2只高剂量组），有六只难产因发现及时未出现死亡。剩下两只难产死亡，解剖后未见明显内脏出血情况，难产的发生与用药之间无明显相关性。
　　3.用药组与生理盐水组相比，小鼠血小板计数明显升高，血小板增多程度随rhTPO浓度增加而有所增加，但无统计学意义。
　　4.用药组与生理盐水组相比，血清生化检测及骨髓纤维化未见明显异常，胎鼠产出率及小鼠存活率均无统计学差异。出生后观察三周，四组均为发现子代小鼠成长异常。
　　5.用药组与生理盐水组相比，血清TGF-β1水平明显升高，脾细胞中Treg比例明显增加，但外周血中Treg未检测到统计学差异。
　　研究结论:
　　妊娠合并ITP小鼠被动模型可在一定程度上模拟人抗血小板抗体介导的ITP，被动模型小鼠血小板降低未影响其分娩过程。rhTPO治疗抗血小板抗体引起的妊娠合并ITP小鼠疗效显著，可较快使血小板数量增加，模拟临床剂量连续用药14天，未明显影响分娩，且对母鼠和胎鼠无明显毒副作用。但是长期影响仍需要进一步的实验来验证。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 TPO受体激动剂治疗原发免疫性血小板减少症患者后细胞因子的改变

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 rhTPO治疗妊娠合并原发免疫性血小板减少症动物模型的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

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