MK801和牛磺酸对1-溴丙烷中枢神经毒性的保护作用及机制研究

摘要

研究目的：
　　1-溴丙烷（1-Bromopopane，1-BP），又称正丙基溴，溴代正丙烷或溴正丙烷，无色液体，有刺激性气味，易挥发，不易燃，在大气中半衰期短，不破坏大气臭氧层，是一种工业用有机溶剂。本研究第一部分实验采用MK80作为干预剂，观察NMDA受体在1-BP中枢神经毒性中的作用;并根据第一部分实验中1-BP染毒后动物大脑中的神经递质含量的分析发现1-BP染毒组大鼠大脑皮层和海马中牛磺酸显著降低，因此第二部分实验选取了牛磺酸作为干预，从氧化应激，凋亡等方面研究补充牛磺酸是否具有保护作用及其机制，为1-BP的神经毒性的预防以及治疗提供理论参考数据。
　　研究方法：
　　1.MK801对1-BP致大鼠中枢神经系统毒性的保护作用及机制
　　1.1 动物处理
　　1.2 水迷宫实验
　　1.3 组织病理
　　1.4 高效液相色谱法
　　1.5 谷氨酰胺含量
　　1.6 Western Blotting
　　2.牛磺酸对1-BP致大鼠中枢神经毒性的保护作用及机制
　　2.1 动物处理
　　2.2 水迷宫实验
　　2.3 各组大鼠大脑MDA水平的检测
　　2.4 高效液相色谱
　　2.5 Western Blotting
　　研究结果：
　　3.1 MK801对1-BP大鼠中枢神经系统毒性的保护作用及机制
　　3.1.1 MK-801对1-BP致大鼠学习记忆能力损伤的影响
　　空间探索实验中，随时间增加，各组大鼠逃避潜伏期均呈逐渐缩短趋势。与对照组相比，1-BP染毒组逃避潜伏期延长，游泳总距离明显增加，差异均具有统计学意义(P＜0.05);MK-801干预组与染毒组相比，逃避潜伏期和游泳总路程减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。定位航行实验中，与对照组相比，1-BP染毒组穿越平台次数明显降低(P＜0.01)，而MK-801干预组与对照相比没有差异（P＞0.05）。实验过程中，各组大鼠的游泳速度无统计学差异（P＞0.05），可排除运动能力受损对实验结果的影响。
　　3.1.2 MK801对1-BP染毒大鼠大脑皮层和海马组织病理形态的影响
　　硫堇染色中，1-BP染毒组大脑皮层中的神经细胞染色变浅，可观察到空泡形态细胞，海马CA1区以及CA3区细胞边界不清，形态皱缩，给予MK-801干预能明显改善神经细胞的形态。NeuN染色神经细胞计数结果显示，1-BP染毒组大鼠海马CA1区和CA3区NeuN阳性细胞数目与对照组相比，分别减少了24.9％和31.7％(P＜0.01)。而MK801干预组的CA1区和CA3区细胞数目与染毒组相比上升（P＜0.01）。
　　3.1.3 MK801对1-BP染毒大脑中氨基酸类神经递质含量的影响
　　1-BP染毒组与对照组相比较，天门冬氨酸在皮层和海马中均升高(P＜0.01)，牛磺酸在海马和皮层中均降低(P＜0.01)，甘氨酸在海马和皮层中均升高(P＜0.01)，谷氨酸没有明显变化，GABA在皮层和海马中均降低，但只在海马中有统计学意义(P＜0.05)。给予MK-801干预后，海马和皮层中甘氨酸以及天门冬氨酸的量与1-BP染毒组相比，明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)。
　　3.1.4 1-BP染毒对大鼠大脑中谷氨酰胺的影响
　　大脑皮层中，1-BP染毒组与对照组相比，谷氨酰胺含量上升了20.1％(P＜0.05)，而MK801干预组与1-BP组相比，谷氨酰胺降低了16.3％(P＜0.05);海马中，1-BP染毒组与对照组相比，谷氨酰胺含量上升了27.3％(P＜0.01)，而MK801干预组与1-BP组相比，谷氨酰胺降低了18.2％(P＜0.05)。
　　3.1.5 MK801对1-BP染毒大鼠大脑NMDA受体亚基表达变化的影响
　　1-BP染毒组与对照组相比，NR2A和NR2B在大脑皮层和海马中均降低(P＜0.01)。给予MK801干预后，与1-BP组相比，NR2A和NR2B均升高(P＜0.01)。
　　3.1.6 MK801对1-BP染毒大鼠大脑炎性反应的影响
　　小胶质细胞免疫组化染色显示，1-BP染毒组小胶质细胞胞体增大，分支增多，呈现“阿米巴”样改变。各组小胶质细胞计数无统计学差异(P＞0.05);对染色细胞进行积分光密度分析，1-BP组与对照组相比，大脑皮层、CA1和CA3区中小胶质细胞染色的积分光密度分别增加了55.2％、52.7％和59.3％(P＜0.01)。给予MK801干预后，与1-BP组相比，小胶质细胞染色的积分光密度显著降低(P＜0.01)。此外，采用蛋白电泳检测了炎性相关蛋白NLRP-3、IL-1β、caspase-1的表达，1-BP组与对照组相比，大脑皮层和海马中NLRP-3、IL-1β、活化的caspase-1表达均明显升高(P＜0.01)。给予MK801干预后，与1-BP组相比，NLRP-3、IL-1β、活化的caspase-1表达降低(P＜0.01)。
　　3.2 牛磺酸对1-BP致大鼠中枢神经毒性的保护作用及机制
　　3.2.1 牛磺酸对1-BP染毒引起大鼠的学习记忆损伤的影响
　　空间探索实验中，随时间增加各组大鼠逃避潜伏期均呈逐渐缩短趋势。与对照组相比，1-BP染毒组逃避潜伏期延长，游泳总距离明显增加，差异均具有统计学意义(P＜0.01)。定位航行实验中，与对照组相比，1-BP染毒组穿越平台次数明显降低(P＜0.01)，而牛磺酸干预组与1-BP染毒组相比，穿越平台次数增加(P＜0.01)，说明1-BP损伤了大鼠的空间记忆能力，而牛磺酸能够明显改善1-BP导致的大鼠空间学习记忆损伤。实验中，各组大鼠的游泳速度无差异，排除运动能力损伤对游泳的影响。
　　3.2.2 牛磺酸对1-BP染毒大鼠大脑组织病理形态的影响
　　大鼠大脑皮层的神经元硫堇染色中，1-BP染毒组的神经细胞染色变浅，有空泡形态的细胞。海马CA1区和CA3区染色中，1-BP染毒组细胞边界不清，形态皱缩，给予牛磺酸干预后动物神经细胞形态趋于正常。NeuN染色及细胞计数表明，1-BP染毒组大鼠与对照组相比，皮层神经细胞计数降低了37.5％(P＜0.01)，而牛磺酸干预低剂量组和高剂量组与1-BP染毒组相比，细胞计数分别升高了33.6％，37.1％(P＜0.01);1-BP染毒组大鼠与对照组相比，海马CA1和CA3区神经细胞计数分别降低了30.2％，33.1％(P＜0.01)，而牛磺酸干预低剂量组和高剂量组与1-BP染毒组相比，CA1细胞计数分别升高了24.5％，27.7％，CA3分别升高了29.3％，32.4％(P＜0.01)。
　　3.2.3 各组大鼠大脑MDA的含量
　　海马中，1-BP染毒组MDA含量与对照组相比，升高了20.1％(P＜0.05);与1-BP染毒组相比，牛磺酸低剂量组和高剂量组MDA含量分别降低了8.3％，32.4％(P＜0.05)。
　　3.2.4 高效液相色谱法检测各组大鼠皮层和海马牛磺酸的含量
　　低剂量磺酸干预组大鼠大脑皮层和海马中牛磺酸含量较1-BP染毒组分别升高了42.5％，50.1％(P＜0.01);高剂量牛磺酸干预组大脑皮层和海马中牛磺酸含量较1-BP组分别升高了57.3％，57.6％(P＜0.01)。
　　3.2.5 牛磺酸对大脑中线粒体复合蛋白表达的影响
　　大鼠大脑皮层中，1-BP染毒组粒体复合体蛋白Ⅰ-Ⅴ表达与对照组相比均明显下降，其中Ⅰ-Ⅳ蛋白表达的差异有统计学意义(P＜0.05)，蛋白Ⅴ的表达没有统计学意义(P＞0.05)，同时给予不同剂量的牛磺酸时，线粒体复合体蛋白Ⅰ-Ⅳ的表达均有不同程度的恢复，各剂量组差异均有统计学意义(P＜0.05，)。
　　3.2.6 牛磺酸对ASK1/P38MAPK蛋白表达的影响
　　给予牛磺酸干预后，降低了大脑皮层和海马中P-ASK1和P-P38的表达，差异具有统计学意义(P＜0.01)。
　　3.2.7 牛磺酸对凋亡相关蛋白的影响
　　给予牛磺酸干预后，与染毒组相比，大脑皮层和海马中Bcl-2升高，BAX降低(P＜0.05)。大脑皮层和海马中，1-BP染毒组与对照组相比，caspase-3降低，但无统计学差异，活化的caspase-3分别升高了55.0％，25％(P＜0.01);cleavead-caspase-3/caspase3分别升高了57.3％，28.2％(P＜0.01)。给予牛磺酸干预后，与染毒组相比，大脑皮层和海马中活化的caspase-3均降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)。
　　研究结论：
　　1.1-BP染毒导致大鼠脑内兴奋性氨基酸升高，抑制性氨基酸降低，引起大脑兴奋效应，NMDA受体敏感性增加，另一方面，NMDA受体NR2A和NR2B功能亚基表达下调，引起学习记忆功能损伤。1-BP染毒引起大脑皮层和海马小胶质细胞的活化，炎症因子表达增加，给予MK801干预后，改善了大鼠学习记忆功能，纠正NR2A和NR2B功能亚基表达异常，明显减轻小胶质的活化以及炎症因子的表达。
　　2.牛磺酸可显著改善大鼠大脑中牛磺酸的降低，拮抗1-BP染毒引起的中枢神经系统氧化损伤，以及通过ASK/P38通路改善1-BP引起的大鼠大脑细胞凋亡，从而显著改善1-BP染毒引起的认知损伤。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一章 MK-801对1-BP中枢神经系统毒性的保护作用及机制

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第二章 牛磺酸对1-BP中枢神经系统毒性的保护作用及机制

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

致谢

攻读学位论文期间成果